两步法：mRNA 逆转录与 qPCR 检测全解析
在分子生物学领域，对于 mRNA 的精确检测是众多研究的基础。从组织、细胞或全血中抽提得到的总 RNA，含有足量的 mRNA、lncRNA 以及 microRNA，这使得总 RNA 能够用于 mRNA 的检测。在 mRNA 检测流程中，两步法是一种经典且常用的技术手段。
一、技术原理与优势
mRNA 检测首先需要对样本进行逆转录，将 mRNA 逆转录为较为稳定的 cDNA。此过程通过第一链 cDNA 合成来实现，所采用的逆转录引物通常为 oligodT 或随机引物 。RNA 的化学性质相对不稳定，而 cDNA 则更为稳定。利用这一特性，一次逆转录所获得的 cDNA 产物，能够用于多个基因的后续检测，极大地提高了检测效率与样本利用率。
二、实验所需试剂
（一）逆转录实验试剂
（二）qPCR实验：
（三）qPCR 实验引物对产品
BioTNT 为科研工作者提供 Preci® mRNA qPCR 引物对。其涵盖范围广泛，包括可用于 human mRNA（30000+）、rat mRNA（30000+）以及 mouse mRNA（30000+）检测的，且经过验证可用于 QPCR 实验的 PCR 引物对。同时，还提供用于均一化检测的内参基因 QPCR 引物对，例如 beta actin、GAPDH、18SRNA 等。
此外，BioTNT 对引物产品进行了全线升级，直接推出 mRNA 检测试剂盒。购买该试剂盒，仅需支付两套引物的费用，即可获得一套完整的检测工具，其中包含目的基因引物、两套内参引物（Actb 和 GAPDH）以及 qPCR mix。产品货号为引物货号 + c2，以此表明该产品为试剂盒套餐。
Preci® qPCR引物对
BioTNT Preci® mRNA qPCR预验证129引物对
（四）通用 PCR 阳性模板
1、产品简介：通用阳性核酸模板由 BioTNT 公司精心制备。公司从众多合作单位收集各类品系动物研究模型，进行分类整理后，分别从心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、结肠、回肠、尾、眼等组织中，利用 Qiagen 核酸试剂盒进行抽提，并通过逆转录得到寡核苷酸链。经过 BioTNT 公司上百次实验验证，该产品在对照验证实验中效果良好，能够直观体现核酸实验成果。
2、产品优势
▶具备广泛的生物学背景，可作为阳性对照应用于多种分子生物学实验。
▶可广泛运用于几乎所有核酸实验，如 SNP、MSP、测序等。
▶覆盖实验室常用的大小鼠各种品系，为经典实验提供有效的阳性参照数据。
▶核酸模板特异性高，不会受到其他品系基因表达的干扰。
▶基因覆盖面广，能够覆盖单一品系几乎所有表达的基因。
三、样本质量把控
（一）样品质量验证
为保证 PCR Array 实验的质量，强烈建议在实验前对样本质量进行验证，具体包括 RNA 定量与质量控制：
1、使用 RNase - free 的无菌水稀释 RNA 样本，随后检测其在 260nm 和 280nm 处的吸光值，要求 A260/280 大于 1.8。
2、依据公式 A260×40× 稀释倍数 = XXXXμg/mL 来计算 RNA 浓度。
3、运用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。
4、在完成 RNA 质量测定并逆转录得到 cDNA 后，建议使用多个内参基因自行验证 cDNA 质量。
同时，推荐购买 BioTNT 的样本质量验证引物套装，该套装包含如 human beta actin、GAPDH、18sRNA 等内参引物，可在进行 qPCR 之前对样本进行有效验证 。
BioTnt qPCR 提供多种内参基因，具体基因编码信息如下：
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引物货号
Cat.
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种属
Species
|
简称
OfficialSymbol
|
基因ID
GeneID
|
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tnt0338g
|
mouse(小鼠)
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Gapdh
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14433
|
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tnt0409c
|
mouse(小鼠)
|
Actb
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11461
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tnt2619c
|
mouse(小鼠)
|
B2m
|
12010
|
|
tnt6643b
|
mouse(小鼠)
|
Rplp0
|
11837
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引物货号
Cat.
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种属
Species
|
简称
OfficialSymbol
|
基因ID
GeneID
|
|
tnt0409b
|
rat(大鼠)
|
Actb
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81822
|
|
tnt2621b
|
rat(大鼠)
|
B2m
|
24223
|
|
tnt2622a
|
rat(大鼠)
|
Hprt1
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24465
|
|
tnt0274e
|
rat(大鼠)
|
Gapdh
|
24383
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（二）基因组污染检测
1、引物货号推荐：当无法确定实验样本中是否存在基因组 DNA 污染时，可使用以下指定引物货号进行检测。这些引物专门用于识别和量化样本中的基因组 DNA 污染，是保障实验准确性的关键工具。
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引物货号
Cat.
|
种属
Species
|
简称
OfficialSymbol
|
基因ID
GeneID
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tnt0049c
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human(人)
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actb内含子
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60
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tnt0048c
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mouse(小鼠)
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actb内含子
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11461
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tnt0050c
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rat(大鼠)
|
actb内含子
|
81822
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2、检测方法简述
▶样本准备：确保 RNA 样品保持原始状态，未经逆转录处理。
▶PCR 扩增：采用推荐的引物货号进行 PCR 扩增，从而特异性地扩增可能存在的基因组 DNA 片段。
▶荧光信号检测：借助实时荧光定量 PCR（qPCR）或其他适用的荧光检测方法，对扩增过程中的荧光信号强度进行观察与记录。
3、污染判断标准
▶若在 PCR 反应中检测到较强的荧光信号，且循环阈值（CT 值）低于 30，则表明 RNA 样本中存在显著的基因组 DNA 污染。
▶基因组 DNA 污染可能会对后续诸如基因表达分析、RNA - seq 等实验结果的准确性与可靠性产生影响，因此建议采取相应措施，如使用 DNase I 处理 RNA 样品以去除 DNA 污染，或重新准备样本。
4、注意事项
▶实验操作过程中，请务必确保规范性和严谨性，防止引入外部污染。
▶对于检测出污染的样本，建议进一步验证并进行去污染处理。
▶如有需要，可随时咨询专业技术支持，以获取更详细的操作指导与解决方案。
mRNA 低丰度分子实验体系：一步法逆转录与 qPCR 检测方案
在现代分子生物学研究中，对于低丰度 mRNA 的精准检测是探索基因表达调控机制、疾病诊断及治疗靶点研究等领域的关键环节。本方案聚焦于一步法逆转录和 qPCR 检测技术，为您呈现高效、灵敏的低丰度 mRNA 检测解决方案。
技术原理与应用优势
从组织、细胞或全血中抽提的总 RNA，富含 mRNA、lncRNA 以及 microRNA，因此可用于这三类核酸分子的检测。对于低丰度基因的 mRNA 检测，我们推荐采用一步法逆转录 mRNA 结合 qPCR 实验。
该一步法采用独特的单链特异性逆转录方式，区别于传统的 oligo dt 和随机引物逆转录方法，从而具备更高的灵敏度和特异性。其显著优势体现在：
▶操作简便：无需单独进行逆转录步骤，极大简化了实验流程。从完成 RNA 抽提开始，总时长可缩短至 1.5 小时即可出结果。
▶灵敏度高：特别适用于低丰度基因的检测，能够精准捕捉微量表达的 mRNA 信号。
实验操作流程
反应体系构建：
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组份名称（目的孔）
|
组份名称（内参孔）
|
加量(μl)
|
反应终浓度
|
备注
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|
Master PCR Mix
|
Master PCR Mix
|
2.5
|
1 x
|
|
|
Enzyme PCR Mix
|
Enzyme PCR Mix
|
2.5
|
1 x
|
|
|
正向引物
（10μM)
|
内参正向引物
（10μM)
|
0.2
|
0.2 μM
|
用户自备
|
|
反向引物
（10μM)
|
内参反向引物
（10μM)
|
0.2
|
0.2 μM
|
|
待检样本
|
待检样本
|
0.5-2
|
≤200ng
|
|
补加DEPC 水至总体积
|
补加DEPC 水至总体积
|
10
|
/
|
仪器设置：
|
步骤
|
温度
|
时间
|
循环次数
|
|
反转录
|
50℃
|
10-15分钟
|
1
|
|
解链及反转录酶灭活
|
95℃
|
5分钟
|
1
|
|
扩增
|
95℃
|
5-10 秒
|
40-45
|
|
✮60℃
|
15-30 秒
|
|
熔解曲线分析
|
使用仪器配套软件进行
|
产品信息：
通过本 mRNA 低丰度分子实验体系，您能够高效、准确地检测低丰度 mRNA，为您的科研工作提供有力支持。
LncRNA qPCR 实验体系与 mRNA 低丰度分子实验体系：一步法逆转录和 qPCR 检测指南
在分子生物学研究中，对特定核酸分子的精准检测至关重要。本文聚焦于一步法逆转录和 qPCR 检测技术，为您详细介绍其在 LncRNA 和低丰度 mRNA 检测中的应用。
样本 RNA 特征与检测适用性
从组织、细胞或全血中抽提的总 RNA，包含足量的 mRNA、LncRNA 和 microRNA，因此可用于这三类核酸分子的检测 。而从血清或血浆中抽提的总 RNA，所含 LncRNA 量较为微量。对于低丰度基因的 LncRNA 检测，推荐采用一步法逆转录 LncRNA 结合 qPCR 实验。
一步法技术优势
本实验采用的一步法逆转录和 qPCR 检测，运用单链特异性逆转录方式，与传统的 oligo dt 和随机引物逆转录方式相比，具有更高的灵敏度和特异性。
简要操作步骤
1、引物定制：可通过 biotnt 进行 LncRNA 引物定制。我们推荐 LncRNA 套餐，包含 LncRNA 引物、内参引物以及 LncRNA 专用一步法 RT - PCR mix，仅需 699 元即可获得 200T×10ul 体系。
2、试剂准备：
3、反应体系构建：
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组份名称（目的孔）
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组份名称（内参孔）
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加量(μl)
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反应终浓度
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备注
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Master PCR Mix
|
Master PCR Mix
|
2.5
|
1 x
|
|
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Enzyme PCR Mix
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Enzyme PCR Mix
|
2.5
|
1 x
|
|
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lncRNA正向引物
（10μM)
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内参正向引物
（10μM)
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0.2
|
0.2 μM
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用户自备
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lncRNA反向引物
（10μM)
|
内参反向引物
（10μM)
|
0.2
|
0.2 μM
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待检样本
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待检样本
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0.5-2
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≤200ng
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|
补加DEPC 水至总体积
|
补加DEPC 水至总体积
|
10
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/
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4、仪器设置：
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步骤
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温度
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时间
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循环次数
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反转录
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50℃
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10-15分钟
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1
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解链及反转录酶灭活
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95℃
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5分钟
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1
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扩增
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95℃
|
5-10 秒
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40-45
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✮60℃
|
15-30 秒
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熔解曲线分析
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使用仪器配套软件进行
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相关产品和服务
1、LncRNA 抽提：依据不同样本类型，选择对应的抽提方式。
2、LncRNA qPCR 引物定制
▶货号：cust - lncRNAp
▶规格：200ul×10um×2
▶客户必填信息：种属（可选）、基因信息编号、数据库（可选）。
▶客户可填信息：备注。
3、LncRNA 的序列查找，引物设计和实验方案推荐：BioTNT 提供专业的 LncRNA 引物设计验证服务。
▶序列查找：可通过 ncbi 或 ensemble 查找 LncRNA 序列。
▶序列比对：将查找到的 LncRNA 序列在 ncbi blast 中进行比对。设计的区段必须具有特异性。由于 ensemble 数据库与 ncbi 数据库存在差异，可能出现难以确认的序列，此时需与客户沟通确认。无法确认的序列不能进行设计；若找不到约 200bp 的特异序列片段，原则上也不能设计，对于较短的特异性序列，建议客户采用探针法设计。
▶引物设计原则：在找到特异性序列后进行设计，设计好的序列需再次与 RNA 序列和基因组序列进行比对。鉴于 LncRNA 通常表达量较低，为排除引物因素，推荐在同一个外显子内设计引物，这样设计出的引物可用基因组样本进行验证。此外，引物设计还需符合 qPCR 的一般原则，如引物长度、产物长度、TM 值、退火温度，且引物二级结构良好，可借助 oligo 软件进行引物结构分析。
▶引物特异性比对：选用同种属的基因组序列和 RNA 序列对引物进行特异性比对，确保引物符合特异性要求。
▶引物合成验证：引物采用 Page 纯化，合成后需通过 qPCR 实验验证，以基因组 DNA 为模板进行验证。理想的产物扩增曲线应为 S 型，熔解曲线为单峰，且 TM 值与引物设计的 TM 值相差不超过 2℃。
▶提供产品：提供上下游两支引物，浓度为 10um，体积为 200ul，采用标准的 qPCR 两步退火方式，可满足 500T 的检测需求。
客户准备事项
1、样本基因组处理：由于 LncRNA 引物采用同一外显子设计方式，扩增产物可在基因组上找到。若要获得准确的表达结果，样本需进行基因组去除处理，可在抽提或逆转录时进行。同时，建议客户抽提一些含基因组的样本，用于引物验证。
2、RNA 抽提方法：尽量采用抽提总 RNA 的方法。
3、逆转录方式：检测 LncRNA 时，因其序列无 poly A 尾，在抽提 RNA 后进行逆转录，可选择随机引物逆转录或特异性引物逆转录。使用 mRNA 的 oligodT + 随机引物逆转录方式，也可检测 LncRNA。
4、内参选择：根据抽提方式和样本情况，若抽提的是总 RNA，可选用 GAPDH、actb 作为内参。
LncRNA 引物定制下单表单填写内容
需填写种属、基因信息编号、数据库，以及备注（可选）。
