产品参数
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QD One Step RT- PCR PreMix（探针法）（单管型）UNG/dUTP
使 用 说 明 书
【规格】
QDpro One Step RT PCR Mix（1ml） 100T： 货号：A2010A006；
QDpro One Step RT PCR Mix（5ml） 500T： 货号：A2010A006L；
【前言】
本产品提供了一个灵敏、高效、快速地扩增并检测RNA 的完整系统。One Step RT- PCR preMix包含所有 RT-PCR 所需的、并经优化的 Reaction Buffer、RT 酶混合物等，使用者只需加入适量的引物、探针和待检样品，即可进行 One Step RT- PCR 检测。
本产品使用高效率 M-MLV 反转录酶和化学修饰的热启动 Taq DNA 聚合酶，为 RT-PCR 反应提供了更高的产量及灵敏度、特异性。
采用的UNG/dUTP系统为PCR防污染系统；本产品使用的UNG酶常温即可起作用，不需要设置专门的反应温度。
本产品适用于开放型数字PCR仪，用户可参考推荐的扩增程序，根据实验结果自行摸索最佳扩增程序。
本产品适用于lncRNA，microRNA, RNA病毒检测进行一步法RT-qPCR 探针法实验。
试验前应准备好用于检测目的基因的引物、探针。引物、探针应用HPLC或PAGE纯化。
本产品可用于多重荧光探针法的qPCR检测。
【用户需要准备的其他物品】
1. 实验用水：使用DEPC处理的PCR用纯水。
2. 待检样品：总RNA，mRNA，或者其他RNA；
3. RNase free & DNase free 的tip头，离心管,薄壁PCR管等；
4. 各种规格的移液器；
5. Real time PCR仪：本产品适用于下列Real time PCR仪：ABI PRISM®7700、7500、7300、7000、Q3，Q5，Q7， BIORAD iCycler 、Roch Light Cycler 480 等Real time PCR仪上使用，具体使用方法请参照相应仪器的说明书。
【反应液配制】
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反应液组份
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加量 (μl)
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终浓度
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备注
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QD RT - PCR mix
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10
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1X
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上游引物（25uM)
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0.3
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0.3uM
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用户自备
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下游引物（25uM)
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0.3
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0.3uM
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用户自备
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探针（25uM)
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0.15
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0.15uM
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用户自备
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待检样品
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5-9
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10pg~100ng
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用户自备
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DEPC H2O
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补足
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用户自备
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总体积
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20ul
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注：1.常初次使用本试剂时，可用引物浓度 300nM，探针浓度 150nM 进行实验，根据实验结果具体情况，在 200～1000nM范围内调整引物浓度，在 50～400nM 范围内调整探针浓度以达到最佳检测效果。
2.引物、探针、待检样品的具体加量用户可以根据实际情况调整，同时增减 DEPC 水用量，保证总反应体积不变即可。
3. 系统中不含oligo dT和随机引物，检测microRNA 请自行添加茎环引物；DEPC 水调整体积。
【RT-PCR 扩增检测】
1 将反应管放入荧光 PCR 扩增仪进行扩增检测。
2 循环参数设定（请参照各类仪器的操作说明进行设置）
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步骤
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温度（℃）
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时间
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循环数（次）
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1
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逆转录反应
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50
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5-15分钟
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1
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2
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反转录酶灭活及解链
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95
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5 分钟
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1
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3
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变性
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95
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5 秒
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40-45
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4
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退火、延伸及检测荧光
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60
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30秒
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步骤 4 中 60℃时荧光检测，检测通道：FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
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注：以上扩增条件为实例，用户应根据引物的 Tm 值及扩增片段的大小来确定适合的变性时间、退火温度，退火时间和循环次数，黑体字部分必须保留。
【保存条件】
本产品原则上在-20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。如果在短期内需持续使用时， 融解后可在4℃保存，最长可保存1周。
【注意事项】
1. 本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。
2. 为保证实验结果的准确性和可靠性，请注意以下事项：
1) 实验室应严格分区，避免 PCR 产物污染。
2) 各组分使用前 2-8℃解冻，室温平衡十五分钟；
3) 实验全过程严防 RNA 酶污染及 RNA 降解；使用已校准的移液器，选用进口一次性使用的 PCR 反应管、离心管、tip 头等进行样本处理及配液等操作，所有用具应不含DNA 酶和RNA 酶。实验样品尽可能新鲜，提取过程应严防RNA 酶污染及操作不当导致的RNA 降解。
4) 斜体字部分时间和温度很重要，不得更改；
5) 根据具体实验结果，建议引物浓度在 0.1-1uM 之间调整，探针浓度在 0.05-1uM 之间调整；
6) 建议使用 10 pg～100 ng 的 Total RNA 为模板；
7) 反转录时间可以根据模板具体情况进行调节，建议不要低于 5分钟；
8) 60 度是荧光定量 PCR 常用的退火温度，需要根据引物、探针设计的具体情况来确定，如退火温度低于 58 度，建议采用三步法扩增 40-45 个循环；延伸时间可根据使用仪器所需要的数据采集最短时间限制自行调整。
9) 本产品使用的 UNG 酶常温即可起作用，不需要设置专门的反应温度。
10) 本产品适用于开放型数字PCR仪，用户可参考推荐的扩增程序，根据实验结果自行摸索最佳扩增程序。
11) 本产品-15~-20℃保存 18 个月，2-8℃保存 1 周产品性能不受影响。
12) 引物、探针设计过程中应尽可能避免发夹结构、二聚体等现象的发生，探针的位置尽可能靠近上游引物, PCR目标片段最好小于200bp，尽可能在150bp以内。
13) 统一配液后分装以减少加样误差，每次实验应设置阴性对照。
14) 禁止标记PCR 反应管，避免外源性荧光信号干扰。
15) PCR 反应管中不能有气泡，否则会产生非特异的荧光信号。若有气泡，可先用手指将气泡弹破，然后再低速离心消除。
16) 实时荧光PCR 仪器连续进行实验时，最好间隔一小时以上再使用。实时荧光PCR 仪需经常校正和清洁载样板板孔。