ELISA包被套餐3     ELISA Construction Pack X使用说明书

Version 2.0

（cat：EL-CPX-5）

（cat：EL-CPX-10）

（cat：EL-CPX-15）

试剂清单：

其他需要使用但试剂盒并未提供的材料：

1.  一抗，生物素二抗，标准品，HRP-Strepavidin 浓缩液；

2.  封板膜（Plate sealer），有粘性，贴在板上，用于板的密封，防止异物跌落在板孔内；货号：EL-CPX08；

3.  ELISA 洗涤液，货号EL-00402，用于洗板；

4.  PBS缓冲液（phosphate buffered solution）即磷酸盐缓冲液，能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力，是生物学中经常使用的缓冲盐溶液。pH为 7.2-7.4，主要成分为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠以及氯化钠，常用于分子克隆及免疫组化等实验. 可稀释成1×PBS,可以替代样品稀释液等组分；也可加tween－20成为自配的洗涤液；

5.  EL-CPI05-20，自封铝箔袋，干燥剂；

注意事项及说明：

Ø  上述试剂均可2-8℃保存，保质期为一年；其中终止液可以室温或低温保存；

Ø  试剂如储存时间较久，请在正式实验前进行预实验验证试剂质量；

Ø  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴防护手套操作。

试剂盒使用说明和包被实验示例：

一、包被液的配制：

coating buffer 包被缓冲液（EL-CPX01）：该试剂为10X 浓缩液，使用前请根据实验用量，用蒸馏水稀释至1X，即配即用，例：10ml coating buffer + 90ml蒸馏水；

 Coating buffer 用于抗体的包被；可替代以PBS为主的包被液体；请用1* coating  buffer和适量一抗配成包被液，抗体浓度请参考抗体的说明。

二、包被实验示例：

在ELISA酶标板（EL-CPX02）中每孔加入100ul包被液（包被液若有剩余可多包被一点，以条为单位），在板上贴膜（封板，plate sealer，），室温（控制室温在25℃，板放置处旁放置温度计控温）温育过夜（下午4点到第二天早上9点，不宜缩短时间，会降低包板效率）；结束温育（也请参考抗体说明书的包被条件进行相应调整）。多余的配好的包被液不能保存。

三、洗板封闭：

1)        将洗液20×Wash Buffer（EL-00402）（可以用PBS +Tween 20代替）配制成1×Wash Buffer（实验前请合理计算用量，配制成足够的量待用），用1×Wash Buffer洗板4次（注：包被组分在加稳定剂前不能剧烈震荡或完全干燥，所以洗板过程需快速、温和，不要拼命拍板）；

2)        洗板后立即加入200ul每孔的酶标板稳定剂（EL-CPX03），37℃温育1小时；

3)        弃掉或吸取酶标板稳定剂（注：拍干，千万不要洗板）。

封闭好的酶标板可以有以下几种处理方式。

方式一：直接进行检测。

方式二：冻干（需有冻干机，长期保存）

1)   冻干成品：把酶标板放入冰箱，-20℃冰箱冷冻过夜。

2)   调试真空冻干机，立即将冷冻过夜的酶标板放入真空冻干机冻干24小时；

3)   取出冻干的酶标板，立即将酶标板放入一个装有干燥剂的铝箔袋内（EL-CPI05-20），贴上标签，放4℃冰箱长期保存。（冻干同时可进行标准品冻干，标准品冻干需要购买标准品冻干液）。(干燥剂和铝箔袋可以单独订购)

方式三：室温晾干（无需冻干机）

按照以下方法晾干长期保存：

1)   室温或者 37°C ；

2)   湿度: 最好在一个湿盒中(小于 15% 湿度)；

3)    时间: 2-24 小时，晾干；确认干燥

4)   立即将将经过酶标板稳定剂处理的产品封装在一个含有干燥剂（EL-CPI05-20）的密闭防潮容器中，正确使用干燥剂包装是长期保存的关键。干燥密封的酶标板可以放置半年以上。

注意：如果酶标板不直接进行检测，必须采用方式二或者方式三，进行干燥。干燥后的酶标板才可以稳定保存。

方式四：短期使用：

如果短期内使用，可以把酶标板放入冰箱，-20℃冰箱冷冻。在使用前一直冷冻在-20度，可以短期保存（酶标板上包被的抗体效价降低很慢）（半个月内使用可以采用本方法）。冷冻后的酶标板放入含干燥剂的酶标板自封袋中，短期保存（半个月内使用）

四、检测方法示例

（请参考抗体说明，安排相应的检测方法，根据您的实验路线，如果是双抗夹心法，可以选择酶标二抗，也可以选择生物素二抗，采用生物素-亲和素的放大系统）：

实验示例：下面是双抗夹心法的实验示例： 

1)        以上的酶标板已经预包被了抗体，选取相应的板条；

2)        标准品请用相应的稀释液稀释；如检测的是血清，标准品用EL-CPX08稀释；如果检测的是细胞上清样品或其他非血清样品，请用EL-CPV03稀释；(本套餐中仅提供一种稀释液，如需另外一种，请单独订购)

3)        酶标板中加入适量稀释好的标准品和样品，各100ul；

4)        37度温育1到2小时；

5)        洗板四次（洗液同上）；

6)        生物素二抗请根据说明书，用生物素（Biotin）稀释液（EL-CPX04）进行稀释；

7)        37度温育30分钟；

8)        洗板四次；

9)        HRP 酶联物，请用（EL-CPX05）稀释；

10)     每孔加入100ul 稀释好的HRP 酶联物，37度温育1小时或其他时间；

11)     洗板四次；

12)     加入显色液：显色液A，B（Substrate A，B）（EL-CPX06）；使用前请按按照A液和B液1：1比例充分混匀，方可使用，使用前15分钟配置；每孔加入50ul-100ul混合后的显色液；室温温育10-30分钟：显色时间根据目测最高浓度标准品的颜色，应为深蓝色，630读数，OD 值应在0.7以上；

13)     加入终止液（Stop Solution）（EL-CPX07）100ul 每孔。

加入终止液50ul-100ul，显色从蓝色转为黄色。建议采用450-630的双波读数。

 注：根据实验设计不同的包被浓度，酶标二抗浓度，HRP浓度，反应时间等变量，找到最优化的实验条件。确定试剂盒定量范围、灵敏度等试剂盒特性。

双抗夹心法可以回归为线性、二次曲线，或者四参数曲线；

竞争法可以回归为log-logit，或者四参数曲线；

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