Pre-miRNA 和pri-miRNA的序列查找，引物设计和实验方案推荐

BioTNT 的引物设计验证服务

（一）序列查找；

ncbi 查找Pre-miRNA序列；

而pri-miRNA 的序列呢，则是pre 序列的扩展序列；

这是右侧的序列起始，我们可以根据这个序列，向上和向下进行扩展（先各扩展50bp）；

扩展后得到的就是pri microRNA 的序列；

（二）引物设计：

根据这个序列，就要进行设计了；当然这个序列的设计也是有技巧的，最重要的原则是：Pre 和Pri 要能够区分；

引物Pri 序列中是包含Pre 序列的，所以我们设计时，总不能Pri 的序列设计出来, Pre 的序列也能扩出来；

所以我们把Pri 序列分为3个部分，分别为1（5‘端扩展序列），2（pre 序列），3（3‘端扩展序列）；所以，上游引物的位置和下游引物的位置，这几种搭配是可以的：

1+2；2+3；1+3；

引物设计还应该符合qPCR 的其他原则，如引物长度，产物长度，TM 值，退火温度；引物二级结构良好等特点，在oligo软件中进行引物结构分析；

（三）引物特异性比对：

请选用同种属的基因组序列对引物进行特异性比对；良好的引物应该符合特异性要求；

（四）引物合成验证：

引物采用Page 纯化，合成后引物应该进行qPCR 实验验证，模板采用基因组DNA 的模板进行验证，得到的产物扩增曲线S 型，熔解曲线单峰，且TM 与引物设计的TM 值相差不超过2度；

（五）提供产品：

提供两支引物，上下游，浓度为10um，体积为200ul，采用标准的qPCR 两步退火方式；可以进行500T的检测；

客户需要准备的：

（一）样本是否需要去除基因组：

由于pre-miRNA的序列和pri-miRNA 序列都可以在基因组上找到，所以如果想要得到准确的表达结果，样本中应该进行基因组的去除处理，可以在抽提的时候进行基因组去除，也可以在逆转录的时候进行基因组去除；

（二）RNA抽提方法：

尽量采用抽提总RNA 方法进行抽提；这个和microRNA 不同，microRNA 可以采用专门抽提的方式或者总RNA 抽提方式，不能采用仅使用mRNA的抽提方式；

（三）逆转录方式：

当然，如果要检测Pre-miRNA，由于序列不存在poly A 尾，所以在抽提了RNA, 进行逆转录时，请选择用随机引物逆转录，或者用特异性引物进行逆转录；

pri-miRNA 的逆转录方式，也是同上面的；

所以，抽提的RNA，用mRNA 的oligodT+随机引物的逆转录方式，也是可以检测PremicroRNA 和PrimicroRNA的；

这个和microRNA 的检测采用茎环法逆转录也是不同的；

（四）内参选择：

根据抽提的方式和样本的情况，如果是抽提总RNA的，可以用GAPDH，actb作为内参。