1. 1×Biotinylated Antibody:用稀释液 II按1:100倍稀释100×生物素化二抗。
2. 1×Streptavidin-HRP Conjugate:用稀释液 III按1:150倍稀释150×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物。
3. 显色液配制:A液和B液做1:1配制,即配即用,可根据使用量临时配制(使用前15分钟内配制),不要配制过多的显色液。
4. 1×洗涤液配制:用蒸馏水1:20倍稀释(示例:1mL 20×浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水);
操作步骤:
样本,细胞上清,细胞裂解液,脑脊液,以及其他生物学样本均需要在正式实验前预实验确认稀释倍数;血清样本一般情况下建议按照50μL 上样。
酶标板是12*8wells的lockwell 形式,属于单孔可折形式,可以按照自己的需要每次拆下相应的板条来进行实验;如果第一次使用biotnt的这款试剂盒,建议您在进行大批量实验之前先进行预实验;
预实验方式:选用1条酶标板,加入标准品2000pg/ml ,8.2pg/ml,0孔;另外,再选择您待测的两个样本,第一个样本选择三个稀释梯度;第二个样本选择两个稀释梯度来进行预实验;
实验步骤:
1. 加样:加入相对应标准品100μL,加入待测样品50μL、稀释液I 50ul(样本已经稀释2倍回归计算时需乘以稀释倍数2), 封板,充分混匀,室温温育120分钟;
2. 洗板:用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次,在吸水纸上拍干;
3. 每孔加入已稀释1× Biotinylated Antibody 100μL,封板,室温温育120分钟;
4. 洗板:同第二步;
5. 每孔加1×Streptavidin- HRP 100μL,封板,室温温育20分钟;
6. 洗板:同第二步;
7. 每孔加入已配制的显色工作液100μL,将反应板置暗处室温5-15分钟,每隔一段时间,目测标准品和样本的板孔变为蓝色, 酶标仪620-630nm 进行读数并保存(第一次数据),标准品孔的最高点读数OD 值如果超过0.8,请及早终止。如果标准品最高点读数没有超过0.4,可以延长室温温育时间为30min,再进行下一步终止反应。
8. 每孔加入50μL终止液,混匀;如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻叩击板框,充分混匀。
9. 在5分钟内进行酶标仪读数,设置双波读数(第二次数据),酶标仪主波长450nm,副波长620-630nm检测吸光度。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去 620-630 nm 的测定值。仅使用450 nm 测定会导致OD值偏高,并且准确度降低。
10. 如果酶标仪没有620-630nm的波长,也可以根据酶标仪的情况选择570-650nm的波长作为替代。
结果计算与判断:
1. 所有OD值都应减除空白值后再计算;先计算450-630nm的数据(第二次数据);
2. 以标准品1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,0pg/mL为横坐标,450-630nm的OD值为纵坐标,画出标准曲线。
3. 根据样本OD值在该曲线图上查出相对应Human IL-10含量,如样本有稀释,请再乘上稀释倍数。如果样本没有进行预稀释,则稀释倍数为2 。计算出的数值应该乘以2。
Standard (pg/mL)
|
O.D. (450 nm-630nm)
|
Mean
|
Zero Standard Subtracted (Std.)-(S1)
|
1000pg/ml
|
2.336,2.344
|
2.340
|
2.280
|
500pg/ml
|
1.17,1.174
|
1.172
|
1.112
|
250pg/ml
|
0.558,0.567
|
0.563
|
0.503
|
125pg/ml
|
0.301,0.307
|
0.304
|
0.244
|
62.5pg/ml
|
0.172,0.179
|
0.176
|
0.116
|
31.3pg/ml
|
0.12,0.123
|
0.122
|
0.062
|
15.63pg/ml
|
0.086,0.094
|
0.090
|
0.030
|
0pg/ml
|
0.057,0.062
|
0.060
|
0.000
|
Human IL-10标准曲线(pg/mL)
试剂盒数据批内差(Intra-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在同一次验证实验中加样20孔,来验证批内差,检测结果如下:
Sample
|
1
|
2
|
3
|
N
|
20
|
20
|
20
|
Mean (pg/mL)
|
34.24
|
333.62
|
667.1
|
SD(pg/mL)
|
2.26
|
16.45
|
21.08
|
CV (%)
|
6.61
|
4.93
|
3.16
|
试剂盒数据批间差(Inter-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在10次不同的实验中进行检测,来验证批间差,检测结果如下:
Sample
|
1
|
2
|
3
|
N
|
10
|
10
|
10
|
Mean (pg/mL)
|
36.95
|
333.7
|
670.12
|
SD(pg/mL)
|
3.17
|
20.29
|
43.49
|
CV (%)
|
8.57
|
6.08
|
6.49
|
试剂盒灵敏度(Sensitivity):
本试剂盒检测Human IL-10的最低浓度为5.21pg/mL,验证实验选取两条标准品进行梯度稀释确认5.21pg/mL以上浓度的反应孔OD值呈正相关线性分布,Human IL-10浓度在5.21-15.63pg/ml之间样本可以被检测到但会有较大偏差,低于5.21pg/mL无法被检出。
试剂盒数据回归性(Recovery):
选取血清、血浆、细胞上清等不同类型的人样本按低浓度、中浓度、高浓度分组稀释做回归性验证实验,将线性回归后的浓度值与理论浓度值相比较统计结果如下:
样本类型
|
Average Recovery%
|
范围%
|
血清
|
105
|
99-111
|
血浆
|
102
|
92-112
|
细胞上清
|
102
|
94-110
|