人肿瘤坏死因子alpha酶联免疫试剂盒

Human TNF-α ELISA Kit

用于血清，血浆，细胞上清及其他生物体液中

人肿瘤坏死因子alpha的检测

货号：A1010A0103

96 tests

仅供科研使用，勿用于药物、临床检测

检测原理：

本试剂盒采用双抗夹心法。用抗Human TNF-α抗体包被于酶标板上，标准品和样本中的Human TNF-α与单抗结合，加入生物素化的抗Human TNF-α，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液，在450nm处测OD值，Human TNF-α浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Human TNF-α的浓度。

试剂盒组份（2-8℃保存）

1.    Human TNF-α 酶标板（coated wells），12*8wells（单孔可折），1 plate；

2.    Human TNF-α 标准品20 ng（standards），2 vial；

3.    Human TNF-α 300×生物素化二抗（Biotinylated Antibody），40μL，1 vial；

4.    Human TNF-α 200×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物（Streptavidin HRP Conjugate），60μL，1 vial；

5.    稀释液I（Assay Diluent I），12 mL，1 vial；

6.    稀释液 II（Assay Diluent II），12 mL，1 vial；

7.    稀释液 III（Assay Diluent III），12 mL，1 vial；

8.    20×浓缩洗涤液（Wash Buffer），50 mL，1 vial；

9.    显色液A（Color Reagent A），6 mL，1 vial；

10.  显色液B（Color Reagent B），6 mL，1 vial；

11.  终止液（Stop Solution），12 mL，1 vial；

未提供的试剂、仪器和耗材：

1.      单道或多道（8道或12道）移液器及移液器枪头：10-200μL和50-1000μL；

2.      多道（8道或12道）移液器试剂存放槽；

3.      EP管及试剂配置容器；

4.      圆柱形量筒：100mL，200mL，500mL和1L；

5.      可在450nm处进行读数的酶标仪； 洗瓶或自动洗板机；

6.      蒸馏水或去离子水；封板膜或板盖；乳胶手套；吸水纸；

注意事项：

1.    严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.    洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.    消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.    底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5.    避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.    在储存和温育时避免强光直接照射。

7.    任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。

8.    标准孔及待测样本均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线，请合理安排预实验。

9.    不能使用过期产品。

样本与试剂准备：

1.      样本：本试剂盒可检测血清，血浆（EDTA，肝素抗凝），细胞培养上清液，组织匀浆等生物学样本。样本储存要求2-8℃保存48小时以内，更长时间需冷冻（-20℃或-80℃）保存，避免反复冻融。如样本Human TNF-α 含量过高，可用稀释液 I进行稀释。

标准品配制：将20ng标准品离心后，加入1000μL的稀释液 I配制成浓度为20ng/mL的标准品溶液，轻轻振荡混匀。取975μL稀释液 I到空EP管中， 加入25μL浓度为20ng/mL的标准品，混匀，配成浓度为500pg/mL的标准品溶液（标准曲线最高点）；再准备六支EP管，分别加入600μL稀释液I，吸取500pg/mL的标准品溶液400μL加入第一管中，充分混匀，从第一管中取400μL加到第二管中，充分混匀，如此反复对半稀释至浓度2.048pg/mL的标准品溶液；另取一空白EP管加入足量的稀释液I，设为空白对照。

1.      1×Biotinylated Antibody：用稀释液 II按1:120倍稀释120×生物素化二抗。

2.      1×Streptavidin-HRP Conjugate：用稀释液 III按1:200倍稀释200×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物。

3.      显色液配制：A液和B液做1：1配制，即配即用，可根据使用量临时配制（使用前15分钟内配制），不要配制过多的显色液。

4.      1×洗涤液配制：用蒸馏水1：20倍稀释（示例：1mL 20×浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水）；

操作步骤：

样本，细胞上清，细胞裂解液，脑脊液，以及其他生物学样本均需要在正式实验前预实验确认稀释倍数；血清样本一般情况下建议按照50μL 上样。

酶标板是12*8wells的lockwell 形式，属于单孔可折形式，可以按照自己的需要每次拆下相应的板条来进行实验；如果第一次使用biotnt的这款试剂盒，建议您在进行大批量实验之前先进行预实验；

预实验方式：选用1条酶标板，加入标准品500pg/ml ，2.048pg/ml，0孔；另外，再选择您待测的两个样本，第一个样本选择三个稀释梯度；第二个样本选择两个稀释梯度来进行预实验；

实验步骤：

1.      加样：加入相对应标准品100μL，加入待测样品50μL、稀释液I  50ul（样本已经稀释2倍回归计算时需乘以稀释倍数2）， 封板，充分混匀，室温温育120分钟；

2.      洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次，在吸水纸上拍干；

3.      每孔加入已稀释1× Biotinylated Antibody 100μL，封板，室温温育60分钟；

4.      洗板：同第二步；

5.      每孔加1×Streptavidin- HRP 100μL，封板，室温温育30分钟；

6.      洗板：同第二步；

7.      每孔加入已配制的显色工作液100μL，将反应板置暗处室温5-15分钟，目测标准品和样本的板孔变为蓝色， 酶标仪620-630nm 进行读数并保存（第一次数据），标准品孔的最高点读数OD 值在0.7-1.0之间，可以进行下一步终止反应；

8.      每孔加入100μL终止液，混匀；如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

9.      在5分钟内进行酶标仪读数，设置双波读数（第二次数据），酶标仪主波长450nm，副波长620-630nm检测吸光度。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去 620-630 nm 的测定值。仅使用450 nm 测定会导致OD值偏高，并且准确度降低。

10.   如果酶标仪没有620-630nm的波长，也可以根据酶标仪的情况选择570-650nm的波长作为替代。

结果计算与判断：

1.      所有OD值都应减除空白值后再计算；先计算450-630nm的数据（第二次数据）；

2.      以标准品500, 200, 80, 32, 12.8, 5.12, 2.048, 0pg/mL为横坐标，450-630nm的OD值为纵坐标，画出标准曲线。

3.      根据样本OD值在该曲线图上查出相对应Human TNF-α含量，如样本有稀释，请再乘上稀释倍数。如果样本没有进行预稀释，则稀释倍数为2 。计算出的数值应该乘以2。

4.      推荐采用双对数方式进行数据拟合。如下是示例数据：

Human TNF-α标准曲线（pg/mL）

试剂盒数据批内差（Intra-Assay）：

选取不同浓度的血浆样本各3例在同一次验证实验中加样20孔，来验证批内差，检测结果如下：

试剂盒数据批间差（Inter-Assay）：

选取不同浓度的血浆样本各3例在10次不同的实验中进行检测，来验证批间差，检测结果如下：

试剂盒灵敏度（Sensitivity）：

本试剂盒检测Human TNFa的最低浓度为0.68pg/mL，验证实验选取两条标准品进行梯度稀释确认0.68pg/mL以上浓度的反应孔OD值呈正相关线性分布，Human TNFa浓度在0.68-2.048pg/ml之间样本可以被检测到但会有较大偏差，低于0.68pg/mL无法被检出。

试剂盒数据回归性（Recovery）：

选取血清、血浆、细胞上清等不同类型的人样本按低浓度、中浓度、高浓度分组稀释做回归性验证实验，将线性回归后的浓度值与理论浓度值相比较统计结果如下：

试剂盒数据特异性（Specificity）：

本ELISA试剂盒可以检测自然或重组Human TNF-α蛋白。本试剂盒不与以下蛋白产生交叉反应：Rat TNF alpha；Mouse TNF alpha; sRANKL;  Human: TNF beta; TNFR1 and R2; TRAIL; TWEAK; TWEAK-R; VEGF; BAFF; sFasL; CD40L 。