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技术宝典—Chromotek
Chromotek nano 二抗的一步法免疫荧光操作示例

nano 二抗的一步法免疫荧光操作示例

 

举例:10min+5min+20min+1hr 的孵育时间,2小时完成免疫荧光实验

1. 实验前一天将细胞接入铺有盖玻片的六孔板内(盖玻片预先用酒精浸泡30分钟左右,使用之前用酒精灯灭菌几秒钟,然后用镊子夹住盖玻片放入六孔板内);

2. 第二天,待细胞融合至70%左右开始;

3. 弃去旧培养基,每孔加入1-2ml PBS,漂洗3min/*3次;

4. 室温,加入1ml 4% 多聚甲醛-PBS溶液中固定细胞10分钟;

5. 吸出4%多聚甲醛,每孔加入1-2ml PBS,漂洗5min/*3次;

6. 吸出PBS,每孔加入0.5%TritonX-100 1ml,室温下孵育5min0.5%TritonX-100PBS稀释);吸出0.5%TritonX-100

7. 每孔加入1-2ml PBS,漂洗5min/*3次;吸出PBS

8. 每孔加入1ml  4% BSAPBS稀释),室温下封闭20分钟;

9. 准备一抗(一抗稀释比例根据说明书,按照推荐浓度的2倍进行准备,用4%BSA-PBS稀释);nano二抗(按照1:500进行稀释, 4%BSA-PBS稀释),把一抗和二抗 各取25ul/每孔进行混匀,每个盖玻片上滴加50ul一抗+nano 二抗的混合物; 10ulnano 二抗可以配成5ml的工作液,每孔25ul,可以做200个六孔板细胞爬片孔的免疫荧光;室温1小时;

10. 每孔加入2ml PBS,漂洗5min/*3-5次;

11. 吸出PBS,每孔加入染核试剂(DAPIHoechst),按照说明书操作;

12. 吸出染核试剂,用PBS漂洗3次;

13. 加入10-20ul封片剂封片;

14. 荧光显微镜下观察拍照(封片好的细胞样品可于4度存放2周以上甚至一年)。

 

对比:

细胞免疫荧光染色实验(间接普通荧光二抗法)

1.实验前一天将细胞接入铺有盖玻片的六孔板内(盖玻片预先用酒精浸泡30分钟左右,使用之前用酒精灯灭菌几秒钟,然后用镊子夹住盖玻片放入六孔板内);

2.第二天,待细胞融合至70%左右开始进行染色;

3.弃去旧培养基,每孔加入1-2mlPBS,漂洗3min/*3次;

4.吸出PBS,每孔加入预冷的4%多聚甲醛1ml,室温下固定细胞20min

5.吸出4%多聚甲醛,每孔加入1-2ml PBS,漂洗5min/*3次;

6.吸出PBS,每孔加入0.5%TritonX-100 1ml,室温下孵育10min0.5%TritonX-100PBS稀释);吸出0.5%TritonX-100

7.每孔加入1-2ml PBS,漂洗5min/*3次;吸出PBS

8.每孔加入1ml 2% BSAPBS稀释),室温下封闭30min-1h

9.吸出2%BSA,勿洗;

10.每个盖玻片上滴加50ul左右一抗(一抗稀释比例根据说明书,用2%BSA稀释),置于4度过夜;

11.次日取出六孔板,每孔加入1-2ml PBS,漂洗5min/*3次;

12.吸出PBS,每个盖玻片上加入50ul左右荧光二抗(二抗稀释比例根据说明书,用2%BSA稀释),室温下孵育1小时(我一般都是4度孵育过夜);

13.每孔加入2mlPBS,漂洗5min/*3次;

14.吸出PBS,每孔加入染核试剂(DAPIHoechst),按照说明书操作;

15.吸出染核试剂,用PBS漂洗3次;

16.加入10-20ul封片剂封片;

17.荧光显微镜下观察拍照(封片好的细胞样品可于4度存放2周以上甚至一年)。

 

 

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