nano 二抗的一步法免疫荧光操作示例

举例：10min+5min+20min+1hr 的孵育时间，2小时完成免疫荧光实验

1. 实验前一天将细胞接入铺有盖玻片的六孔板内（盖玻片预先用酒精浸泡30分钟左右，使用之前用酒精灯灭菌几秒钟，然后用镊子夹住盖玻片放入六孔板内）；

2. 第二天，待细胞融合至70%左右开始；

3. 弃去旧培养基，每孔加入1-2ml PBS，漂洗3min/次*3次；

4. 室温，加入1ml 的4% 多聚甲醛-PBS溶液中固定细胞10分钟；

5. 吸出4%多聚甲醛，每孔加入1-2ml PBS，漂洗5min/次*3次；

6. 吸出PBS，每孔加入0.5%TritonX-100 1ml，室温下孵育5min（0.5%TritonX-100用PBS稀释）；吸出0.5%TritonX-100；

7. 每孔加入1-2ml PBS，漂洗5min/次*3次；吸出PBS；

8. 每孔加入1ml  4% BSA（PBS稀释），室温下封闭20分钟；

9. 准备一抗（一抗稀释比例根据说明书，按照推荐浓度的2倍进行准备，用4%BSA-PBS稀释）；nano二抗（按照1:500进行稀释, 用4%BSA-PBS稀释），把一抗和二抗 各取25ul/每孔进行混匀，每个盖玻片上滴加50ul一抗+nano 二抗的混合物； 10ul的nano 二抗可以配成5ml的工作液，每孔25ul，可以做200个六孔板细胞爬片孔的免疫荧光；室温1小时；

10. 每孔加入2ml PBS，漂洗5min/次*3-5次；

11. 吸出PBS，每孔加入染核试剂（DAPI或Hoechst），按照说明书操作；

12. 吸出染核试剂，用PBS漂洗3次；

13. 加入10-20ul封片剂封片；

14. 荧光显微镜下观察拍照（封片好的细胞样品可于4度存放2周以上甚至一年）。

对比：

细胞免疫荧光染色实验（间接普通荧光二抗法）

1.实验前一天将细胞接入铺有盖玻片的六孔板内（盖玻片预先用酒精浸泡30分钟左右，使用之前用酒精灯灭菌几秒钟，然后用镊子夹住盖玻片放入六孔板内）；

2.第二天，待细胞融合至70%左右开始进行染色；

3.弃去旧培养基，每孔加入1-2mlPBS，漂洗3min/次*3次；

4.吸出PBS，每孔加入预冷的4%多聚甲醛1ml，室温下固定细胞20min；

5.吸出4%多聚甲醛，每孔加入1-2ml PBS，漂洗5min/次*3次；

6.吸出PBS，每孔加入0.5%TritonX-100 1ml，室温下孵育10min（0.5%TritonX-100用PBS稀释）；吸出0.5%TritonX-100；

7.每孔加入1-2ml PBS，漂洗5min/次*3次；吸出PBS；

8.每孔加入1ml 2% BSA（PBS稀释），室温下封闭30min-1h；

9.吸出2%BSA，勿洗；

10.每个盖玻片上滴加50ul左右一抗（一抗稀释比例根据说明书，用2%BSA稀释），置于4度过夜；

11.次日取出六孔板，每孔加入1-2ml PBS，漂洗5min/次*3次；

12.吸出PBS，每个盖玻片上加入50ul左右荧光二抗（二抗稀释比例根据说明书，用2%BSA稀释），室温下孵育1小时（我一般都是4度孵育过夜）；

13.每孔加入2mlPBS，漂洗5min/次*3次；

14.吸出PBS，每孔加入染核试剂（DAPI或Hoechst），按照说明书操作；

15.吸出染核试剂，用PBS漂洗3次；

16.加入10-20ul封片剂封片；

17.荧光显微镜下观察拍照（封片好的细胞样品可于4度存放2周以上甚至一年）。