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标签蛋白介绍以及chromotek 相关产品
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重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。
除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将标签的功能初步介绍如下：
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| 分类 |
产品类别 |
抗体特异性 |
chromotek货号 |
荧光标签 |
GFP-Trap®绿色荧光蛋白抗体偶联的琼脂糖珠/琼脂糖磁珠 |
AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomeric eGFP A206K；CFP, eCFP, mCerulean YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet BFP |
gta-20
gtma-20 |
| 荧光标签 |
RFP-Trap®红色荧光蛋白抗体偶联的珠子 |
mRFP, mCherry, mRFPruby, mPlum, tagRFP, mKate2 |
Rta-20
Rtma-20 |
| 荧光标签 |
mNeonGreen-Trap单体黄绿色荧光蛋白抗体偶联的珠子 |
Branchiostoma lanceolatum（文昌鱼） |
nta-20，ntma-20 |
| 特殊荧光标签 |
Halo 标签 |
Halo-tag |
ota-20 |
| 特殊荧光标签 |
SNAP/CLIP-tag®-Trap |
SNAP-tag and CLIP-tag |
wta-20 |
| 遗传标签 |
Spot-Trap® |
spot tag |
eta-20，etma-20 |
| 遗传标签 |
Myc-Trap® |
Myc-tag |
yta-20，ytma-20 |
| 遗传标签 |
GST-Trap® |
GST-tag |
sta-20 |
| 遗传标签 |
MBP-Trap |
MBP-tag |
mbta-20 |
| 表观遗传类蛋白 |
Dnmt1-Trap |
特殊蛋白Dnmt1 |
dta-20 |
| 肿瘤蛋白 |
Mdm4/ HdmX-Trap |
特殊蛋白Mdm4/ HdmX |
hta-20 |
| 肿瘤蛋白 |
MK2-Trap |
特殊蛋白MK2 |
mta-20 |
| 肿瘤蛋白 |
p53 N-term-Trap |
特殊蛋白p53 N-term |
pta-20 |
| 肿瘤蛋白 |
p53 C-term-Trap |
特殊蛋白p53 C-term |
pta2-20 |
| 肿瘤蛋白 |
PARP1-Trap |
特殊蛋白PARP1 |
xta-20 |
荧光标签： GFP ，RFP， 新型的mNeonGreen
绿色荧光GFP 包括：AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomeric eGFP A206K；CFP, eCFP, mCerulean， YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet BFP，就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
红色荧光RFP 包括：mRFP, mCherry, mRFPruby, mPlum, tagRFP, mKate2，其中mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。
mNeonGreen ：美国Scintillon研究所光生物学与生物成像系的Nathan C Shaner从头索动物文昌鱼的四聚体荧光蛋白中分离获得了一种新的单体黄绿色荧光蛋白mNeonGreen。 这是目前最新的青色荧光蛋白的优良荧光共振能量转移（FRET）受体。研究显示mNeonGreen是亮度最强的单体绿色或黄色荧光蛋白，执行特殊成像效果与融合标签在传统成像中的效果一样好，可用于随机单分子超分辨成像的融合标记。
这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
1.不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。
2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。
3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。
4.其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。
5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒，研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒，研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程．用mRFP标记慢病毒颗粒，研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。
Halo Tag能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。
Halo-tag™是一种自我标记标签，它是由微生物紫红红球菌（Rhodococcus rhodochrous）的脱卤素酶（dehalogenase）演化而来。该酶可把卤代烷烃（haloalkanes）中的卤素取代基去除，通过置换脱卤素酶活性中心的组氨酸，使得去卤素反应的第二步反应速度大大降低，从而令烷基残基可以有效地以共价键形式结合于蛋白上。Halo-tag™是分子量为33kDa的蛋白标签，可以在原核表达系统（大肠杆菌表达系统）或真核表达系统中与待研究蛋白的N端或C端融合表达。
当利用基因融合技术将目标蛋白和Halo-tag™融合表达后，在生理条件下就可以将Halo-tag™荧光配体或者生物素直接定点标记在融合蛋白的Halo-tag™上。这种共价结合特异性高、不可逆且形成快速，生成的复合物稳定性强，甚至在变性条件下也能进行。因此，可以利用这个特性进行PAGE电泳胶显色以及亲和纯化等实验。而当融合表达载体转染到活细胞中表达融合蛋白，就可以进行活细胞中的蛋白荧光示踪——追踪某个蛋白质的产生、分布定位、甚至蛋白质的迁移等情况了。
SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。
SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。
检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。
将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。
SNAP和CLIP-tag 系统使所有分子共价连接到一个感兴趣的蛋白质成为可能。使用这个系统有两个步骤：感兴趣的蛋白质的克隆和表达，用选择好的SNAP-tag底物对融合蛋白进行标记。SNAP-tag是基于人O6-烷基鸟嘌呤-DNA alkyltransferase (hAGT) 的一个小蛋白，是DNA修复蛋白。SNAP-tag底物可以是通过苄基连接的染料，荧光，生物素，或结合鸟嘌呤的珠子或氯嘧啶[型]离去基团。在标记反应中，底物取代苄基与共价键共价连接。CLIP-tag™是一个SNAP-Tag的修饰后的标签，能特异性的与benzylcytosine （BC）衍生物反应；而不是设计与benzylcytosine苄基鸟嘌呤衍生物（benzylguanine，BG)的反应。SNAP-tag与CLIP-tag同时使用，可以在同一细胞中同时对两种蛋白质进行标记。
(4).png)
详细请参考：Chromtek 新品上市之SNAP/CLIP-Trap, 近期最受关注的荧光系统
(1).png)
C-Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。
识别 Myc-tag, 也叫作 c-myc tag, 序列为EQKLISEEDL ，可以位于N端，C端或者融合蛋白的中间。
GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。
纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。
如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。
MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。
纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。 缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测
Spot 标签是12个氨基酸组成的融合标签，序列为：PDRVRAVSHWSS。Spot 标签可以强烈的结合在Spot-Nanobody 上面，该序列可以插入在N端，C端或者蛋白中间。该插入工作可以用引物，通过PCR 进行插入，或者可以采用Spot 载体来进行。Spot 标签蛋白可以在微生物，酵母，哺乳细胞系和昆虫中进行表达。
Spot-Tag® 结合蛋白可以结合到琼脂糖珠子或者磁珠上面。 Spot-tag binding protein,或者称为 anti-Spot-Tag nanobody ， anti-Spot-Tag VHH是没有重链的抗体。Spot-Trap 剩余的亲和残基，可以进行有效的亲和纯化。
特殊蛋白Trap：表观遗传学相关蛋白Dnmt1 Trap
肿瘤蛋白Trap：Mdm4/ HdmX-Trap ，MK2-Trap ，p53 N-term-Trap ，p53 C-term-Trap
这几个不是标签抗体的Trap， 而是用于表观遗传学研究和肿瘤蛋白研究的相关Trap。
(1).png)
DNMT1是全基因组维护负责人DNA复制和修复期间的甲基化，而3A和3B催化从头甲基化，建立新近获得的表观遗传标记。许多研究表明DNMT的基因变异与多种人类癌症的倾向相关，dnmt 1是主要的真核DNA甲基转移酶，在发育过程中起着调控基因表达和基因组稳定性的表观遗传网络的重要作用。chromotek 提供抗Dnmt1 VHH 抗体和相应的trap 产品。
MDM4是肿瘤抑制蛋白P53最重要的负性调控因子之一, 研究发现MDM4在多种肿瘤中异常扩增或过度表达,如乳腺癌、视网膜母细胞瘤等。肿瘤组织内异常扩增的MDM4通过直接抑制P53的转录功能和(或)降低P53的稳定性抑制P53蛋白的抗肿瘤活性,进而促进肿瘤细胞的增殖。近年来MDM4作为一种潜在的抗肿瘤治疗靶点受到广泛关注,同时靶向MDM4的小分子抑制剂进展迅速。
Mdm4 / HdmX - Trap是一种高质量的Mdm4 / HdmX结合蛋白，与单价基质(琼脂糖颗粒)偶联，用于Mdm4 / HdmX及其相互作用的生化分析。Mdm4 / HdmX / MdmX 通过抑制p53和p73在细胞周期调控和凋亡中发挥作用。注意，Mdm4 / HdmX - Trap的结合会受p53与Mdm4 / HdmX的结合的干扰。
His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。
使用His-tag有下面优点：
1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；
2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；
3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；
4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；
5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；
6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。
Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。
2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。
3.FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。
SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。
此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点
AviTag标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。
Avi Tag标签系统具有以下几大优点:
1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化；
2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；
3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。
HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。
来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控，因为它们对目的基因的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。
优点：灵敏度高，检测幅度宽；不是哺乳动物细胞内源性基因；重复性好；与HTS兼容等。萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研究。由于它们都是快速，容易和高灵敏的监测方法。而且萤火虫和海肾荧光素酶是理想的双基因报告系统，因为它们来源于不同的生物进化方向，蛋白结构和底物差异都很大，在实验中不会产生相互影响。
基于荧光素酶的特性，常用于分析双报告系统中Gaussia荧光素酶（GLuc）和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性。GLuc 和SEAP均为分泌型报告蛋白，无需裂解细胞即可便捷的从细胞培养液中取得样本，并对实验结果进行精准的实时分析。
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