Chromotek 的GFP 产品这些特点 ,你知道么?
(Q&A) 以下资料来源于chromotek 官网资料,由BioTNT进行翻译整理而得;
1. GFP-Trap® 的图表,信息量有些大:
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agarose beads
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magnetic agarose beads
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magnetic particles
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matrix
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agarose
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agarose
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silica (non porous)
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货号
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gta-20
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gtma-20
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gtm-20
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珠子颜色
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white
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black
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brown
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珠子直径
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90µm
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40µm
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0,5-1µm
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binding capacity(结合力)
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12µg/10µl
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8µg/10µl
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3-4µg/10µl
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是否可用磁力
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no
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yes
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yes
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可离心
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3000 x g
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3000 x g
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3000 x g
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BioTNT解读:gta-20 结合力好,gtma-20 次之,gtm-20 结合力比较差;
gtma-20 和gtm-20可以用磁力方式进行洗脱;三者都可以用离心方式进行洗脱。如果仅根据结合力进行选择,可以选gta-20; 如果考虑结合力和磁力的实验操作方式,可以选择gtma-20; 不推荐gtm-20(结合力差,性价比低);
2.我能从GFP-Trap®洗脱结合蛋白吗?
对于定量洗脱,您可以在95°C的SDS样品缓冲液中煮沸样品10分钟(见方案),或在0.2M甘氨酸pH 2.5中孵育0.5至2分钟,然后用1 / 10 vol 1M Tris碱中和。
3.是否有可能从天然状态的GFP-Trap®洗脱结合蛋白,例如用于凝胶转移实验或功能测定?
您可以尝试用游离GFP洗脱。但是,请注意,该方法不会定量洗脱您感兴趣的融合蛋白。
4.如何避免与GFP-Trap®结合的非特异性蛋白相互作用?
关键步骤是稀释培养缓冲液中洗涤剂的浓度。我们建议洗涤剂的终浓度为0.1 % (例如NP - 40或TX - 100 ),终体积至少为0.4毫升。此外,我们建议测试洗涤缓冲液中的各种盐浓度(例如150mM – 500mM NaCl),以去除非特异性结合的亲水蛋白。
5.洗脱的GFP结合蛋白会与IgG 特异性二抗交叉反应吗?
由于GFP - Trap中使用的结合蛋白与山羊、小鼠、大鼠或人抗体没有任何显著的同源性,因此不应发生与第二Ig特异性抗体的非特异性反应。
6.当我使用N端和C端GFP融合时,结合有什么不同吗?
GFP-Trap® 对C末端GFP融合具有稍高的亲和力。您可以通过延长培养时间( 1 - 2h,而不是15 - 30分钟)来补偿这一点。
7.我可以直接从组织样品中纯化GFP标记的融合蛋白,即在变性缓冲液中纯化吗?
原则上,即使在苛刻的缓冲条件下(例如含有0.1 % SDS或1M尿素的RIPA缓冲液),GFP-Trap®也是非常稳定的。
8.GFP标记的结构是否有可以结合到GFP-Trap®珠子上的尺寸限制?
没有.
9.如果洗脱液中有残留背景,该怎么办?
我们建议使用我们的结合对照( Bab - 20、bmab - 20或BMP - 20 )来预检验样品。
GFP-Trap® 可以识别哪些GFP 衍生体?
GFP-Trap® 可识别:
· eCFP, CFP, mCerulean
· eGFP, wtGFP, GFP S65T, AcGFP, TagGFP, tagGFP2, sfGFP, pHluorin
· eYFP, YFP, Venus, Citrine
10. RFP-Trap® 可以识别哪些RFP 衍生体?
RFP-Trap® 可识别: mRFP, mCherry, mRFPruby, mPlum, tagRFP, mKate2
11. GFP-Trap®生物物理参数是什么?
分子量: 14,1kDa
消光系数: 27055 M-1 cm-1
12. RFP-Trap®的生物物理参数是什么?
分子量: 15,1 kDa
消光系数: 30035 M-1 cm-1
13. Nano-Traps的解离常数是多少?
通常重链抗体对其抗原具有高亲和力,解离常数在低纳摩尔至皮摩尔范围内。chrometek已确定了以下KD值:
GFP-Trap: 1 pM, 皮摩 (10-12 摩尔)*
RFP-Trap: 5 nM, 纳摩(10-9 摩尔)
MBP-Trap: 4 nM, 纳摩(10-9 摩尔)
GST-Trap: 1 nM, 纳摩(10-9 摩尔)
*动力学参数使用了switchSENSE technology进行测量,用电可转换纳米杠杆分析分子间的相互作用。switchSENSE是来自Dynamic Biosensors的专有技术(www.dynamic-biosensors.com)。