Corning Transwell 选择指南（BioTNT 技术部整理）：

第一部分：选择指南一

选择合适的Transwell® 膜和孔径

第一步：确定需要的膜（是哪一个：聚碳酯（PC ），聚酯（PET ）和胶原包被的 PTFE膜）；

第二步：确定需要的孔径；（0.4,1.0,3.0,5.0,8.0,12um）

第三步：确定需要用的孔板，是六孔板，12孔板，还是24孔板；

备注：

corning的transwell 均未包被基质胶（Matrigel，需要另向BD 购买）

如果需要包被FN，也可以购买或者直接购买已经包被胶原的corning transwell。

Corning的相关transwell 产品有以下6种嵌套产品：

1、聚酯（PET ）Tranwell 嵌套 （聚酯Transwell-透明嵌套的特点是带有在显微镜下呈透明的膜。这些膜经过处理，可以让细胞更好的贴附和生长。Transwell-透明嵌套使细胞在相差显微镜下更易观察，可以估计细胞的生长状态和单层细胞的形成。 ）（6, 12和24孔板及10cm培养皿中独立使用）

2、胶原包被的Tranwell-COL嵌套 （Transwell-COL嵌套湿润时透明的，胶原包被的PTFE膜，使得细胞更易贴附和伸展，同时在培养的过程中可以观察。Transwell-COL含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合I型和III 型胶原。不同于传统包被技术会形成密封的膜层，康宁专利包被技术使具有生物稳定性的胶原包裹住滤膜的每一根纤维，从而保持了膜的多孔性。）（6, 12和24孔板及10cm培养皿中独立使用）

3、聚碳酯Transwell嵌套 （聚碳酯Transwell嵌套提供从0.4um到12.0um多种孔径。所有的膜都经过处理，使得细胞更易贴附。 ）（6, 12和24孔板及10cm培养皿中独立使用）

4、Snapwell 嵌套 （在扩散或Ussing chambers 模型中使用）略

5、高通量筛选HTS Transwell-24系统 （按特殊规格包装以方便操作和自动处理）略

6、HTS Transwell-96系统（按特殊规格包装以方便操作和自动处理）略

另有配套6 ，12和24孔细胞培养板需要购买。

这些多孔板表面经过细胞培养处理以利于细胞吸附，γ射线灭菌，保证无热源。所有的板都有统一的面积以及凸起的边圈以便于堆放。 数字字母标记为每个孔提供了标识。6.5 ，12与 24.5mm Transwell嵌套的设计使得它们与对应培养板配套使用时自动位于中间位置。

第二部分：选择指南二

选择孔径：

在实验中使用Transwell®通透性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的。表2总结了通透性支持物的常规应用和推荐使用的孔径。小孔径的Tanswell膜（0.4um ）主要应用于药物转导研究。细胞侵袭，趋化性和运动性研究通常采用3.0um或以上的孔径的Tranwell膜。

细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系及培养条件有关，同时也与孔径相关。小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过。对于一些要求严格的实验，康宁建议在实验中选用一系列孔径作为对照来确定哪种尺寸适合于你的细胞培养和特殊应用。还有一个方法就是参照已经发表的文献的推荐。若需更多的使用和应用信息， 请访问康宁网站上技术信息部分的Transwell。

传统Transwell通透性支持物                                                

Transwell嵌套可以提供四种膜直径6.5mm  （24 孔板）， 12mm  （12孔板），24mm(6 孔板)和75mm  （100mm培养皿）。表4列出了这些尺寸可以提供的细胞生长面积。

相对于每个规格，都有几种类型的膜和大范围的孔径可选择。具有专利的中心悬挂设计可以防止培养液由嵌套壁和孔壁之间通过毛细作用流失。悬挂设计使得嵌套与底部有1mm的差距，这样可以保证在嵌套移走的时候，形成的单层细胞不会被破坏。在嵌套壁上的缺口可保证与底部接触。

第三部分：实验protocol 网上资料汇总整理：

以下来自网上资料汇总，请用户在使用前结合产品说明书，确定实验protocol：

Transwell是一类有通透性的杯状的装置。     
    根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支 架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室 （Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，根据实验需要，可有不同选择。其关键 部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其 余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据 不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸 酯膜（polycarbonate membrane）。    将Transwell小室放入培养板中，小 室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我 们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通 透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

(1)、共培养体系：
小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

(2)、趋化性实验
可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

(3)、肿瘤细胞迁移实验
常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
(4)、肿瘤细胞侵袭实验
常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质 胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

第四部分：网上汇总肿瘤细胞侵袭实验transwell

（一）、所需试剂及设备：
        ① Transwell小室；

多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，也有用的是Chemicon公司（millipore）的ECM550系列，价格非常贵；另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell。
这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵， Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小 室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，应该比较适合中国国情。
② 上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA；

③ 细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞 MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。
④ 基质胶：
常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可 逆。同样的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右。
如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。
⑤ 下层培养液：
下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是合适的。
⑥ 细胞培养板：
常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔常用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
⑦ 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原 （collagen）或明胶（gelatin）。很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。 linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，好还是在膜下层涂上FN。
另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。
zhangyong1036战友提供的价格： sigma的fibronectin，价格在1500左右。

（二）、操作步骤：
2．1 Transwell小室制备
2．1．1 无基质胶Transwell小室制备
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室 的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。

2．1．2 有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

2．2 制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。
具 体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果后用计数法统计结果的话将难以计 数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

2．3 接种细胞
① 取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200µl。
② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间 常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培 养板。
③ 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
以 我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细 胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则 一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞 数目本身就比对照组少而引起的了。
时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改 变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时 间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。
另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象
在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

2．4 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：

 （1）直接计数法
     A、“贴壁”细胞数：这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。通过细胞染色，可在镜下计数细胞。

       ①用棉签擦去基 质胶和上室内的细胞；

       ②染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。本实验采用0.1%结晶紫染色；

      ③细胞计数：使用正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也可用手术刀将膜切下后染 色，再 贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存。随机选取5个视野计数细胞个数。
   B、“非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数。

（2）间接计数法。

间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。

 ①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；

 ②24孔板中加入50ul含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出；

 ③24孔板中加入500ul DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。