人外周血淋巴细胞的提取方法
一、全血中血浆的采集、处理和保存
1、 真空采血针采集3ml 新鲜血液，加入EDTA抗凝管中；
2、 30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染；
3、 将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心5min；
4、 全血分两层液体，上层为血浆，下层为含红细胞，淋巴细胞的剩余血样；
5、 根据你的实验需要，取适量上清夜血浆进行各种ELISA测定，保存温度如下说明，无额外处理，如有加抑制剂，请参考说明书。
说明：
1、 储存条件：2-8℃下，可放置保存24-48小时；-20℃下，可放置保存1个月；-80℃下，可放置保存6个月；
2、 请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求，建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA，抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；
3、 全血量一般为3ml；一般地，3ml外周血中含有大约1-2×106个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞），分离可得1.5ml血浆和1.5ml剩余血样。
二、密度梯度分离淋巴细胞
1、 取1.5ml 无菌无酶的离心管，先加入500ul淋巴细胞分离液；
2、 取另一个1.5ml 无菌无酶的离心管中，加入500ul剩余血样和500ul 1×PBS，1：1混匀，共1ml；
3、 然后缓慢把混匀的血样1×PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管中（注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了，已溶血样本不会分层，整个分离液都是红的，很难提取）；
4、 1500rpm，室温离心15mins（离心后，红细胞完全沉底，淋巴细胞位于上清中层，呈白色絮状）。
说明：
1、 从采集血样到开始实验的时间好不超过24h。实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、 关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室 温时，摇匀后使用； 整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存， 本品为真空包装，未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）。淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与 泛影酸葡甲胺。适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、 转数为1500rpm，时间范围为15mins，温度为室温20℃。推荐两步离心法：首先用1500rpm离心15mins，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用1500rpm离心15mins。
三、获取淋巴细胞团块
1、 用移液器（200ul档）吸取分离液层中的淋巴细胞（如担心吸取不完全，可多吸取周边的分离液，然后离心清洗即可，不要吸到红细胞）；
2、 把吸取的含淋巴细胞的溶液转移至另一无菌离心管中；
3、 加入1ml 1×PBS缓冲液到离心管中清洗（如吸取液体过多，可先离心弃上清然后再清洗）；
4、 1500rpm，室温离心15mins；
5、 离心后弃上清，取沉淀；
6、 重复清洗步骤一次；
7、 离心所得细胞团块加入1ml TRIzol可提取RNA做PCR，适量非变性裂解液可提取蛋白做ELISA，适量变性裂解液可提取蛋白做Western Blotting
说明：
1、 洗涤后离心的条件，通常用1500rpm就足够了，太高了容易把细胞离死。时间为15mins，温度还是室温20℃；
2、 离心后，看到淋巴细胞中混有少量红细胞，在这个实验中问题不大；
3、 洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。一般洗涤液PBS用1ml即可；
4、 离心所得细胞团块可4℃保存1天，也可加入TRIzol或裂解液后-20℃保存1个月；
5、 后续实验参考各实验样本制备方法中细胞处理方法。