Introduction

本实验是检测microRNA的相对定量表达；

实验步骤概述：

1.       根据microRNA序列，设计目的引物，去合成；

2.       存于液氮中的组织或细胞用invitrogen 的trizol进行总RNA的提取；(根据要求不同，如果组织很小，细胞数量少，采用qiagen的抽提试剂盒进行抽提，收费有差异)；

3.       提出的总RNA用biotnt 的茎环逆转录试剂盒进行逆转录得到特异性CDNA（不同的microRNA，以及不同的内参需要进行不同的逆转录）；

4.       cDNA可在real Time PCR中进行内参的验证，来验证提取和转录的效率，确定能进行实验的样本；

5.       目的引物的预实验；（real Time PCR）；

6.       扩大性预实验；（real Time PCR）；

7.       正式实验；（real Time PCR）；

8.       判断实验数据，进行计算；

Primer

microRNA基因序列是从mirbase上面查得(www.mirbase.org/)；microRNA的内参采用snordRNA，序列来自ncbi 数据库；采用oligo和primer5来设计引物；

采用茎环引物，BioTNT特异性引物试剂盒由biotnt 进行设计合成，验证后提供；货号可以在www.biotnt.com 官网上查询；

Sample

Ø  总RNA的提取：

方法一、用invitrogen的trizol进行总RNA的提取；实验操作参照：《P001 TRIzol® Reagent》、《P002 Trizol实际使用参考资料》；

方法二、采用Qiagen 的microRNA 抽提试剂盒进行抽提；

方法三、采用biotnt 磁珠法抽提试剂盒进行抽提；

Ø  microRNA逆转录成为cDNA模板：

使用Biotnt RNU6B - miRNA 内参 qRT-PCR  Sybgreen Detection Kit中的逆转录部分试剂盒，选择内参茎环引物和特异性茎环引物进行逆转录；参照《P003 Biotnt miRNA 内参 qRT-PCR  Sybgreen Detection Kit》的逆转录部分进行试验；

Ø  以特异性cDNA为模板进行real time PCR实验：

参照《P003 Biotnt miRNA 内参 qRT-PCR  Sybgreen Detection Kit.doc》的qPCR 部分，进行试验；

Material & Methods

实验所用试剂：

1.      trizol，invitrogen；

2.      DEPC，国药；

3.      无水乙醇、氯仿、1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips(RNase-free)，灭菌的DEPC dd水；

4.      Biotnt RNU6B - miRNA 内参 qRT-PCR  Sybgreen Detection Kit(包含A2030A001 ，microRNA逆转录试剂盒（茎环法），内参引物assay，A2030A002 microRNA PCR premix) ；《P008 A2030A001(x3) 茎环法miRNA逆转录试剂盒》

5.      BioTNT特异性引物试剂盒；货号可以在www.biotnt.com 官网上查询；

抽提可选试剂：

6.      磁珠法RNA抽提试剂盒（组织/细胞）A2010A103 《P004 A2010A103 磁珠法RNA抽提试剂盒使用说明书（组织，细胞）》

7.      磁珠法RNA抽提试剂盒（血液，体液）  A2010A104《P005 A2010A104 磁珠法RNA抽提试剂盒（血液，体液）》

8.      血清/血浆样本可选：miRNeasy Serum/Plasma Kit（50） 217184       microRNA 抽提Qiagen

实验相关仪器：

1.      微型离心机，GyroSpin，GYROZEN；

2.      旋涡混合器，GL-88B，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

3.      恒温金属浴，HB-100，杭州博日科技有限公司；

4.      qPCR仪，ViiA7，life technology（ABI）；

5.      离心机，TDL-80-2B，飞鸽牌；

6.      超细匀浆器，F6/10-6G，FLUKO（上海）流体机械制造有限公司；

7.      移液器，10ul/200ul/1000ul，Dragonlab；

实验相关耗材：

1.      1.5ml无色离心管，MCT-150-C，Axygen

2.      200ul 黄吸头，T-200-Y，Axygen

3.      0.5-10ul 透明Gilson吸头，Axygen

4.      0.6ml无色离心管，MCT-060-C，Axygen

5.      384孔PCR板，PCR-384-C，Axygen

6.      封板膜，伯乐。

实验步骤

第一步、总RNA的提取：

从组织中提取总RNA ：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol，另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。

从细胞中提取总RNA ：细胞样品按10^6个/mlTrizol 加入Trizol，另外，细胞数量不宜过少，否则抽提效果会不好，用1000ul移液器吹打200次/样，或者用超声破碎仪破碎细胞。

操作步骤：

1.      组织匀浆或细胞破碎后後，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。

2.      12000rpm 离心5min，弃沉淀。

3.      按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀後室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

4.      4℃12000g离心15min。

5.      吸取上层水相，至另一离心管中。 注：1）千万不要吸取中间界面。 2)若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。

6.      按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

7.      4℃ 12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

8.      按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

9.      4℃ 8000g离心5min，尽量弃上清。

10.   室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

11.   可用50ul H2O，溶解RNA样品，55-60℃5-10min。 注：H2O均须用DEPC处理并高压。

注意：

1.      组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量。

2.      组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染。

3.      高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨後须4℃ 1200离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉。

4.      热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源。 来自"http://www.transhold.org/wiki/Invitrogen_Trizol_%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E"

第二步、提取出的总RNA进行特异性逆转录，成为cDNA模板：

以内参U6B 举例，采用RNU6B - miRNA 内参 qRT-PCR  Sybgreen Detection Kit

RNU6B - miRNA 内参 qRT-PCR sybgreen Detection Kit包括了三部分，PartA 为RNA 进行逆转录的所有成分，包括一种全新高效逆转录酶、反应缓冲液及该实验中必需的反应组分；使用该试剂盒能够以microRNA为模板, 通过茎环引物合成microRNA的cDNA 第一链，可以用于120个RNA 进行逆转录合成CDNA；Part B为real time PCR的染料Premix，该premix 经过优化，可以适合以microRNA 为模板转录的CDNA 进行的real time PCR 实验；Part B提供了充足的Premix，可用于CDNA 进行360次real time PCR实验； Part C 为real time PCR的特异性上下游引物，以及可以用做质控的阳性RNU6B CDNA 模板；另试剂盒中提供一支RNA 酶，DNA 酶free的双蒸水，可用于360次体系的配制。

注意：

本试剂盒用于成熟的microRNA的逆转录。提供的组分足够用于120次特异性CDNA 的逆转录和360次 real time PCR实验。

一、使用Biotnt RNU6B - miRNA 内参 qRT-PCR Sybgreen Detection Kit, 采用的是两步RT-PCR；

第一步：使用试剂盒Part A 部分提供的试剂进行逆转录，得到CDNA；

第二步：请使用试剂盒Part B部分提供的PCR mix 和Part C部分提供的特异性引物，以及进行real time PCR 实验

试剂盒组分（120T)

《P009 microRNA qRT-PCR syb kit》说明书程序：

1.      在0.5ml微量离心管中（无菌无RNA酶，货号A2010B0X04），加入总RNA 1μg（如果不计算浓度值，直接加入1 ul RNA）；注：总RNA 中应含有小RNA(small RNA)；总RNA的量应在1ng-5ug之间；如果采用特殊的专门抽提小RNA的试剂盒，RNA的量应在0.1ng-1ug 之间；

2.      配制逆转录反应体系

注：如果n份RNA 要进行microRNA的逆转录；建议增加10%的余量，以便进行分装；举例，如果有10个样本要进行人U6B 的逆转录和人mir21 的逆转录；建议各配11个人份；

3.      混匀後，42℃反应60min；95度5分钟；

4.      如果以上操作与试剂盒中的说明书不符，以试剂盒中的说明书为准。

5.      cDNA产物如不马上进行real time PCR实验，应置于-20℃保存。或者保存于-80度，可以保存6个月。

来自"http://www.transhold.org/wiki/RT-PCR_%E4%B8%A4%E6%AD%A5%E6%B3%95%E7%9A%84CDNA%E5%90%88%E6%88%90%E5%B8%B8%E7%94%A8%E8%AF%95%E5%89%82%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E%E2%80%94%E2%80%94promega_MMLV"

第三步、以cDNA为模板，进行real time PCR实验；

使用准备：

引物溶解：先12000rpm离心5分钟，然後用ddH2O溶解成100μM，然后配成2uM的工作浓度（10*）, 加水量根据引物合成报告单提供的计算方法计算。

【反应液配制】

1.      反应体系中，引物常规终浓度可设为200nM。

2.      在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。我们采用的是20ul 中加1ul的cDNA模板。

3.      适用的荧光定量PCR仪：ABI，MJ

4.      本次实验选用的仪器为：ABI ViiA7

【扩增条件】

AB 系统仪器，Biorad  IQ系列仪器可以完全参照以下的条件：

95℃ 5mins→95℃ 15s→ 60℃ 30s（读荧光）→95℃ 15s；60℃ 30s（0.3℃/s）；95℃ 15s

                   40 cycles（可选）

Discussion：

数据分析部分：

进行分析请参考经典文献《P006 Analysis of Relative Gene Expression Data》

下载页面：http://www.biotnt.com/support/download.aspx?t=20

实时 PCR 终分析的是阈值循环或CT。

CT值通过PCR信号的对数值和循环数来确定。因此CT值是一个指数而非线性概念。因此，在任何统计分析中都不要用原始的CT值来表示结果。正如我们在前文中所描述的一样，PCR相对量通常和内标和参照样本一起计算而很少直接用 C T值来表示，除非我们想检验重复样本之间的差别。为了向大家显示这一点，我们用SYBR Green通过real-time PCR来检测相同cDNA的96个重复反应。所有反应组分在同一管中混好後分装到96个管中，做实时PCR分析，得到了每一个样本的CT值。为了比较样品间变化，计算了96个样本的平均±SD，如果通过原始CT值计算，平均±SD是20.00±0.193，CV为0.971%。但是如果把原始Ct值用2-△CT转化成线性形式，平均±SD是9.08×10-7±1.33×10-7，CV为13.5％。从这个简单的例子我们可以看出，通过原始CT值来反映变化是错误的，应该避免。用2-△CT将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异更准确可靠。

分析样本的公式为：通过2-△CT计算将统计数据转化成线性形式。

我们提供的数据形式是原始数据文件，以及实验数据记录；包括可用的数据的原始数据来源；以及计算好的平均CT值，以及通过 2-△CT 计算将统计数据转化成线性形式的数据值。统计计算示例请参考《P007 如何应用BIOTNT 提供的real time PCR数据进行统计计算示例》