Introduction

本实验是检测mRNA的相对定量表达；

实验步骤概述：

1.       存于液氮中的组织或细胞用invitrogen 的trizol进行mRNA的提取；

2.       提出的mRNA用BioTNT  的MMLV系统进行逆转录得到CDNA；

3.       cDNA可在real Time PCR中进行内参的验证，来验证提取和转录的效率，确定能进行实验的样本；

4.       设计目的引物，去合成；

5.       目的引物的预实验；（real Time PCR）；

6.       扩大性预实验；（real Time PCR）；

7.       正式实验；（real Time PCR）；

8.       判断实验数据，进行计算；

Primer

基因序列是从NCBI上面查得；采用oligo和primer5来设计引物；

引物序列等实验完全结束以后提供给客户；

设计好的引物由invitrogen公司合成；

Sample

Ø  mRNA的提取：

用invitrogen的trizol进行mRNA的提取；实验操作参照：《P001 TRIzol® Reagent》、《P002 Trizol实际使用参考资料》；

Ø  mRNA逆转录成为cDNA模板：

实验操作参照：《P005 cDNA第一链合成试剂盒》；

Ø  以cDNA为模板进行real time PCR实验：

Real Time PCR反应液配制（20μl反应体系，染料法）采用的是BioTNT公司的产品；引物是从invitrogen合成；实验操作参照：《P004 mRNA RT-PCR Detection Kit Munual》；

Material & Methods

实验所用试剂：

1.      trizol，invitrogen；

2.      DEPC，国药；

3.      无水乙醇、氯仿、1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips(RNase-free)，灭菌的DEPC dd水；

4.      Biotnt 逆转录试剂盒；《P005 cDNA第一链合成试剂盒》；

5.      Biotnt 染料法PCR master mix；

6.      引物，invitrogen 合成；

实验相关仪器：

1.      微型离心机，GyroSpin，GYROZEN；

2.      旋涡混合器，GL-88B，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

3.      恒温金属浴，HB-100，杭州博日科技有限公司；

4.      qPCR仪，ViiA7，life technology（ABI）；

5.      离心机，TDL-80-2B，飞鸽牌；

6.      超细匀浆器，F6/10-6G，FLUKO（上海）流体机械制造有限公司；

7.      移液器，10ul/200ul/1000ul，Dragonlab；

实验相关耗材：

1.      1.5ml无色离心管，MCT-150-C，Axygen

2.      200ul 黄吸头，T-200-Y，Axygen

3.      0.5-10ul 透明Gilson吸头，Axygen

4.      0.6ml无色离心管，MCT-060-C，Axygen

5.      384孔PCR板，PCR-384-C，Axygen

6.      封板膜，伯乐。

实验步骤

第一步、mRNA的提取：

从组织中提取总RNA ：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol，另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。

从细胞中提取总RNA ：细胞样品按10^6个/mlTrizol 加入Trizol，另外，细胞数量不宜过少，否则抽提效果会不好，用1000ul移液器吹打200次/样，或者用超声破碎仪破碎细胞。

操作步骤：

1.      组织匀浆或细胞破碎后後，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。

2.      12000rpm 离心5min，弃沉淀。

3.      按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀後室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

4.      4℃12000g离心15min。

5.      吸取上层水相，至另一离心管中。 注：1）千万不要吸取中间界面。 2)若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。

6.      按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

7.      4℃ 12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

8.      按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

9.      4℃ 8000g离心5min，尽量弃上清。

10.   室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

11.   可用50ul H2O，溶解RNA样品，55-60℃5-10min。 注：H2O均须用DEPC处理并高压。

注意：

1.      组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量。

2.      组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染。

3.      高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨後须4℃ 1200离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉。

4.      热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源。 来自"http://www.transhold.org/wiki/Invitrogen_Trizol_%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E"

第二步、提取出的mRNA进行逆转录，成为cDNA模板：

试剂盒组分（50T)

RT体系配制准备：

拿到该试剂盒後，先做如下准备：

DEPC ddH2O：100ml 的ddH2O 加入0.2ml的DEPC, 高温灭菌（事实上提RNA时应该已经配好了）。

引物溶解（oligo（dT）18）：先12000rpm离心5分钟，然後用DEPC ddH2O溶解成50μM，加水量根据引物合成报告单提供的计算方法计算。

计算方法如下：

引物合成单上提供合成的nmol数，如果是30，则加300ulDEPC水成为100uM的原液。加600ulDEPC水成为50uM的原液。以此类推。

说明书程序：

1.      在0.5ml微量离心管中（无菌无RNA酶， 用DEPC水处理），加入总RNA 2μg，补充适量的DEPC ddH2O使总体积达11μl。在管中加50μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。

2.      70℃加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

3.      在每管中（原来有12ul），加入RT反应液13ul（混匀後分装），总体积为25ul：

4.      混匀後，42℃反应60min

5.      如果以上操作与试剂盒中的说明书不符，以试剂盒中的说明书为准。

6.      cDNA产物应置于-20℃保存。

来自"http://www.transhold.org/wiki/RT-PCR_%E4%B8%A4%E6%AD%A5%E6%B3%95%E7%9A%84CDNA%E5%90%88%E6%88%90%E5%B8%B8%E7%94%A8%E8%AF%95%E5%89%82%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E%E2%80%94%E2%80%94promega_MMLV"

第三步、以cDNA为模板，进行real time PCR实验；

使用准备：

引物溶解：先12000rpm离心5分钟，然後用ddH2O溶解成100μM，然后配成2uM的工作浓度（10*）, 加水量根据引物合成报告单提供的计算方法计算。

【反应液配制】

1.      反应体系中，引物常规终浓度可设为200nM。

2.      在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。我们采用的是20ul 中加1ul的cDNA模板。

3.      适用的荧光定量PCR仪：ABI，MJ

4.      本次实验选用的仪器为：ABI ViiA7

【扩增条件】

AB 系统仪器，Biorad  IQ系列仪器可以完全参照以下的条件：

95℃ 5mins→95℃ 15s→ 60℃ 30s（读荧光）→95℃ 15s；60℃ 30s（0.3℃/s）；95℃ 15s

                   40 cycles（可选）

Discussion：

数据分析部分：

进行分析请参考经典文献《P006 Analysis of Relative Gene Expression Data》

下载页面：http://www.biotnt.com/support/download.aspx?t=20

实时 PCR 终分析的是阈值循环或CT。

CT值通过PCR信号的对数值和循环数来确定。因此CT值是一个指数而非线性概念。因此，在任何统计分析中都不要用原始的CT值来表示结果。正如我们在前文中所描述的一样，PCR相对量通常和内标和参照样本一起计算而很少直接用 C T值来表示，除非我们想检验重复样本之间的差别。为了向大家显示这一点，我们用SYBR Green通过real-time PCR来检测相同cDNA的96个重复反应。所有反应组分在同一管中混好後分装到96个管中，做实时PCR分析，得到了每一个样本的CT值。为了比较样品间变化，计算了96个样本的平均±SD，如果通过原始CT值计算，平均±SD是20.00±0.193，CV为0.971%。但是如果把原始Ct值用2-△CT转化成线性形式，平均±SD是9.08×10-7±1.33×10-7，CV为13.5％。从这个简单的例子我们可以看出，通过原始CT值来反映变化是错误的，应该避免。用2-△CT将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异更准确可靠。

分析样本的公式为：通过2-△CT计算将统计数据转化成线性形式。

我们提供的数据形式是原始数据文件，以及实验数据记录；包括可用的数据的原始数据来源；以及计算好的平均CT值，以及通过 2-△CT 计算将统计数据转化成线性形式的数据值。统计计算示例请参考《P007 如何应用BIOTNT 提供的real time PCR数据进行统计计算示例》