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技术宝典— ELISA
BioTNT ELISA 04 ------ 技术服务Protocol

Introduction

 

本实验是检测蛋白的定量的技术方法;

实验步骤概述:

1.       确认样本种属、目的蛋白信息,订购相应成品试剂盒;

2.       血清(浆)和体液加入蛋白酶抑制剂后可直接使用;

3.       存于液氮中的组织或细胞用蛋白裂解液进行蛋白的提取;

4.       提出的蛋白用BCA系统进行蛋白初定量;

5.       ELISA预实验(确认试剂盒灵敏度、检测范围及样本的有效性);

6.       ELISA正式实验(优化并固定实验条件,完成所有样本与靶标蛋白);

7.       通过标准品浓度及OD值建立标准曲线,进行线性回归计算待测样本的浓度值;

 

Kit

试剂盒信息是从BioTNT官网上面查得,也可通过公司市场专员查询;

1.       确定实验动物种属和ELISA检测指标;

2.       确定试剂盒可检测的标本类型,如血清、抗凝血浆、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液、关节滑液、组织匀浆、细胞培养上清液等;

3.       根据标本数量,确定要购买的试剂盒的规格和数量;

4.       复孔:为了增加结果的可靠性,对标准曲线和标本,要求做双复孔或者三复孔,就是同一份标本,平行做两次或者三次;

5.       确定标本的采集时间;根据采集时间来安排标本的保存条件、何时进行试剂盒的购买、如何进行预实验的安排、如何进行大批量标本的检测

 

Sample

Ø  血清的采集、处理和保存:

1、真空采血针采集2ml新鲜血液,加入无菌试管中;

2 采血后室温静置1小时;

3 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

4 取上清。从组织或细胞内提取裂解物:

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的 ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染,因为菌体中可能含有含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜 时检测。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。

 

Ø  血浆的采集、处理和保存:

1 真空采血针采集2ml新鲜血液,加入无菌试管中;

2 1:9加入抗凝剂(EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠),30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染;(也可以直接用抗凝管采集);

3 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心5min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

4 取上清。

请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求,建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。

 

Ø  尿液的采集、处理和保存:

1、采集尿液样本500ul,加入无菌试管中;

2、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,将离心好的样本留上清,弃下面沉淀;

3、取上清,分装冻存备用。

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

Ø  脑脊液的采集、处理和保存:

1、采集脑脊液样本,加入无菌试管中;

2、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,将离心好的样本留上清,弃下面沉淀;

3、取上清,分装冻存备用。

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

Ø  细胞上清液的采集、处理和保存:

1、采集细胞培养上清液500ul,加入无菌试管中;

2、将采集细胞上清用离心机4℃,2500rpm离心10min,将离心好的细胞上清液留上清。

3、取上清,分装冻存备用。

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

 

 

Material & Methods

 

试剂盒组份:

1.      96孔微孔板(预包被第一抗体)

2.      生物素化二抗

3.      标准品

4.      链霉素化HRP

5.      显色液

6.      终止液

7.      各种稀释液

8.      洗涤液

 

实验相关仪器:

1.      手掌型离心机,LX-100,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;

2.      漩涡混合器,GL-88B,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;

3.      高速离心机,GS207013042gyrozen

4.      12孔高速微量离心机MicroSmart,北京昊诺斯科技有限公司

5.      迷你水平摇床,MH-1,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;

6.      电热恒温水槽,DK-420,上海精宏实验设备有限公司;

7.      电热恒温水槽,DK-421,上海精宏实验设备有限公司;

8.      恒温金属浴,HB-100,杭州博日科技有限公司;

9.      电子天平,ES120D&T

10.   酶标仪,318C+,上海市沛欧分析仪器有限公司;

11.   迷你水平摇床,MH-1,海门市其林贝尔仪器制造有限公司

12.   移液器,10ul/200ul/1000ulDragonlab

 

实验相关耗材:

1.      1.5ml无色离心管,MCT-150-CAxygen

2.      200ul 黄吸头,T-200-YAxygen

3.      0.5-10ul 透明Gilson吸头,Axygen

4.      0.6ml无色离心管,MCT-060-CAxygen

5.      96孔酶标板,Nunc

 

实验步骤

第一步、配置标准品

1.      阅读说明书,确认标准曲线标准品浓度最高的一点,配置标准品浓度最高点;

2.      倍半稀释标准品浓度最高点至标准品浓度最低点;

3.      设标准品或样品稀释液为零孔。

 

第二步、加样、孵育

1.      96孔板每个孔中加入固定体积标准品以及样本,贴上封口膜(注意记录样品稀释倍数);

2.      按说明书上温度和时间条件孵育,目的是将样本中的待测靶标蛋白与包被在96孔板上的一抗结合。注:此步孵育时间长可以提高信号,过长会导致杂信号过高。

 

第三步、清洗

1.      用双蒸水稀释浓缩洗液至1×洗液;

2.      弃掉孔板中多余的液体;(靶标蛋白已经结合在孔板上,剩余液体为杂质)

3.      每个孔加入洗液浸没加样孔,温和振荡半分钟,弃掉洗液;

4.      按说明书要求次数重复清洗,最后一次弃掉洗液,在吸水纸上拍干。

 

第四步、二抗孵育

1.      根据说明书配置生物素化二抗,如果是即用型不用配置;

2.      每孔加入固定体积生物素化二抗,按说明书上温度和时间条件孵育,目的是与结合在板上的待测靶标蛋白结合。注:此步孵育时间长可以提高信号,过长会导致杂信号过高。

 

第五步、清洗

1.      同第三步。

 

第六步、链霉素化HRP孵育

1.      根据说明书配置链霉素化HRP,如果是即用型不用配置;

2.      每孔加入固定体积链霉素化HRP,按说明书上温度和时间条件孵育,目的是与结合在板上的二抗生物素结合。注:此步孵育时间长可以提高信号,过长会导致杂信号过高

 

第七步、清洗

1.      同第三步。

 

第八步、显色和终止

1.      根据说明书配置显色液,如果是即用型不用配置;

2.      每孔加入固定体积显色液,按说明书上温度和时间条件孵育显色;

3.      显色时间到,每孔加入固定体积终止液;

4.      将终止后的96孔板放入酶标仪中,调整主波长和副波长,检测OD值,保存。

 

第九步、计算

1.      以标准品的浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,拟合一条线性标准曲线(曲线方程);

2.      将待测样本吸光度代入曲线方程内,回归计算得到待测样本浓度;

3.      将回归得到的待测样本浓度再乘以样本加样前的稀释倍数,得到原管中待测靶标蛋白浓度含量。

 

 

Discussion

 

一、实验的结果判断

定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出""""的简单回答,分别用"阳性""阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测 定系统 中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果,即用滴度来表示反应的强度,其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中,将标本作一系 列稀释後进行试验,呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低,可以判断标本反应性的强弱,这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具 定量意义。

在间接法和夹心法ELISA中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反,阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同,分述于下。

间接法和夹心法应该用酶标仪(酶标比色仪)测定吸光值,这样可以得到客观的数据。

在竞争法ELISA中,阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量,一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间,此时反应最为敏感。

竞争法ELISA因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异,必须用酶标仪读数,进行计算。

 

二、测定结果计算

ELISA操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

测定大分子量物质的夹心法ELISA,标准曲线的范围一般较宽,曲线最高点的吸光度可接近2.0,绘制时常用半对数纸,以检测物的浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,将各浓度的值逐点连接作线性计算,所得曲线一般呈S形,其头、尾部曲线趋于平坦,中央较呈直线的部分是最理想的检测区域,将测得的待测样本吸光度代入线性曲线中就能得到相应的浓度,这个过程叫做回归计算,从标准曲线描绘到待测样本浓度值得出的过程叫做线性回归。

测定大分子量物质的夹心法ELISA,某些试剂是直线回归;某些试剂是二次曲线回归;某些试剂是双对数直线回归;某些试剂是四参数曲线回归;可根据R2和残差平方和调整回归曲线。

如果对酶标仪的软件计算比较熟悉,也可以用酶标仪设定软件来进行计算。由于不同的试剂盒对应的软件计算公式可能不同,而且一旦操作存在误差的话,人工分析可以对偏差点进行舍弃处理,所以一般不推荐仅采用酶标仪一种方式的数据计算。

部分仪器自带分析软件,可以进行定量拟合处理并输出定量值。

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