一、Western 实验中细胞的采集、处理和保存

1、贴壁细胞，加1ml PBS清洗，弃上清，加RIPA（六孔板200ul，培养瓶400ul）冰上消化半小时，细胞刮板，将RIPA转移至EP管，用枪吹打细胞RIPA液200次；

2、细胞团块，加1ml PBS重悬细胞，分装至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，加50ul RIPA冰上消化半小时，用枪吹打细胞RIPA液200次；

3、悬浮细胞或细胞冻存液细胞，转移至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，加1ml PBS重悬细胞，分装至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，加50ul RIPA冰上消化半小时，用枪吹打细胞RIPA液200次；

4、保存

  上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月；

二、Western 实验中易碎组织（脑、肝、肾）的采集、处理和保存

1、样品大小50-100mg，按质量体积比1:5加入RIPA；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中电动匀浆机（每个样本20-30s）或超声破碎；

4、保存

  上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月；

三、Western 实验中不易碎组织如（心肌、肌肉组织）的采集、处理和保存

1、样品大小50-100mg，按质量体积比1:5加入RIPA；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月；

备注：心肌、肌肉组织无法用匀浆机匀浆，组织块会绞入钻头形成团块，无法被匀浆机刀头切碎，需用研磨或超声才能充分破碎。

四、Western 实验中上皮组织（皮肤、膀胱、肠）的采集、处理和保存

1、样品大小50-100mg，按质量体积比1:5加入RIPA；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月

备注：上皮组织韧性较强，较难剪碎，需要增加组织破碎时间才能充分破碎。

五、Western 实验中小颗粒组织（如：神经节、小鼠眼角膜、巩膜、韧带）的采集、处理和保存

1、按样本大小加入适量的RIPA；

2、冰水浴中用显微剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月

备注：小颗粒组织量比较小，会有蛋白浓度量低于检测限度的风险，且样本量太少，无法被匀浆机刀头切碎，需用研磨或超声才能充分破碎；研磨时应格外细心。

六、Western 实验中骨头组织的采集、处理和保存

 1、用已消毒过的咬骨钳将骨组织咬碎

 2、加入适量RIPA，放入冰箱，浸泡半天，使骨头软化

 3、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块

 4、冰水浴中电动匀浆机（每个样本20-30s）或超声破碎；

 5、保存

  上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月

七、Western实验中全血的采集、处理和保存

  1、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；

  2、从全血中提取淋巴细胞后，加入100-200ul的RIPA裂解淋巴细胞；（全血提取淋巴细胞见附录）

  3、超声破碎或用枪吹打200下；

  4、保存；

     将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使蛋白降解）

    -20℃下，可放置保存1个月；

    -80℃下，可放置保存6个月；

备注：全血千万不能放入干冰中送样，应室温保存

附录I：抗凝剂

抗凝是用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。能够阻止血液凝固的物质，称为抗凝剂或抗凝物质。常用抗凝剂和使用方法如下。

1、乙二胺四乙酸（EDTA）盐常用有钠盐或钾盐，能与血液中钙离子结合成螯合物，使Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固。根据国际血液学标准化委员会（ICSH）建议，CBC抗凝剂用量为EDTA-K.2H2O1.5～2.2mg/ml血液。不适于凝血检查、血小板功能试验。

2、草酸盐常用有草酸钠、草酸钾、草酸铵，溶解后解离的草酸根离子能与样本中钙离子形成草酸钙沉淀，使Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固。2mg草酸盐可抗凝lml血液。但不适于凝血检查。而且，草酸盐浓度过高还会导致溶血、改变血液pH，干扰血浆钾、钠、氯和某些酶活性的测定。

双草酸盐抗凝剂：适用于血细胞比容、CBC、网织红细胞计数等检查，不适于血小板计数、白细胞分类计数。

3、肝素是加强抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶作用，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。肝素是红细胞透渗脆性试验的理想抗凝剂。但不适于CBC、细胞形态学检查。每毫升血液肝素用量为（15±2.5）U，多为肝素钠盐或钾盐。

4、枸橼酸盐常用有枸橼酸钠，能与血液中钙离子结合形成螯合物，阻止血液凝固。枸橼酸盐抗凝剂的抗凝力不如上述抗凝剂。枸橼酸钠与血液的抗凝比例为1：9或1：4.适用于红细胞沉降率、凝血检查，是输血保养液的成分。

附录II：裂解液

附录III：蛋白酶抑制剂

PMSF：

特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。

溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇， +25℃时稳定至少9个月

分子量：174.2

使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mM

Leupeptin 亮肽素

特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月

分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6

C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6

使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)

Aprotinin抑肽酶

特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶， 激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。pH约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6512

使用：贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度：0.06–2.0 ug/ml(0.01–0.3 uM)

Pepstatin胃蛋白酶抑制剂

特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶，肾素，组织蛋白酶D，凝乳酶， 许多微生物酸性蛋白酶

溶解性：溶于甲醇约1mg/ml； 可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月

分子量：685.9

使用：贮存浓度：1mg/ml，使用浓度：0.7 ug/ml(1 uM)

EDTA-Na2

特性：金属蛋白酶抑制剂

溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月

分子量：372.24

使用：工作浓度：0.2–0.5 mg/ml(0.5–1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8-9时再加入。

NaF氟化钠

特性：磷酸酶抑制剂

溶解性：溶于水

分子量：41.99

使用： 贮存液：5M    工作浓度：10-20mM

Na3VO4 原矾酸钠

特性：磷酸酶抑制剂

溶解性：溶于水

分子量：183.91

如果购买过来的是原矾酸钠，需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠，激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用。原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是：

(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中，加酸调节PH至10(颜色变黄)

(2).煮至无色

(3).室温冷却

(4).重调PH至10

(5).重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色，并且pH稳定于10，分装100ul/管，每10ml裂解液加一管。(终浓度为1mM)，-20度保存。

使用： 贮存液：100mM 工作浓度：1mM

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