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技术宝典— 样本处理
BioTNT ELISA 10 ------ ELISA检测糖尿病专题篇

样品处理汇总表

注:以下汇总了国际主流的糖尿病检测试剂盒的品牌如:日本shibayaji,美国crystalchemmerck millipore,美国ALPCO, 瑞典mercodia

 

 

一、   样本基本处理方式:

样本类型

General Protocol

作用

部分试剂盒推荐

血清

静脉穿刺取血,待血液凝集完全后离心

样本基本收集方式,不加抑肽酶也可,但样本容易降解

CRYSTAL CHEM insulinmercodia insulinAlpco insulinMillipore insulin

 

血浆

静脉穿刺取血,加入抗凝剂(肝素、EDTA、柠檬酸钠)离心,推荐用EDTA 和柠檬酸钠

血清,血浆+抑肽酶

1ml 血清或抗凝血浆中加入10ul

储存样品时加入抑肽酶可提高样品稳定性(可以作为insulin 样本收集的基本方法)

例如:Shibayagi- Insulin ELISA Kit Leptin ELISA Kit, 其他糖尿病检测试剂盒(除活性GLP-1 检测)

血清,血浆+抑肽酶+DPP-IV抑制剂

每毫升血浆需加10ul DPP-IV

可检测活性Active –GLP-1

采集血浆时加入DPP-IV抑制剂可以提高 活性GLP-1的稳定性

Milliproe- GLP-1 (Active) ELISA Kit Shibayagi- GLP-1 (Active) ELISA Kit

抗凝管

采集血浆时使用抗凝管可减少血液凝血(也可不用)

非必需

Mercodia- Glucagon ELISA Kit CRYSTAL CHEM- Rat GLP-1 ELISA Kit

 

二、  样品稳定剂的使用方法:

 

A.     抑肽酶Aprotinin

BDPP_IV抑制剂

C. P800抗凝管

品牌

国产品牌

Millipore

Becton Dickinson

货号

A8260

DPP4

36642

规格

5mg

1mL

100

储存

贮存液:5mg500ul 水复溶,终浓度10mg/mlpH7-84

 

4

 

密封保存

使用方法

1ml 血清或抗凝血浆中加入10ul5mg可处理50ml样品

每毫升血浆需加10ul DPP-IV

 

采集血浆时收集血液

三、  糖尿病检测的常规问题:

1.       为什么检测insulin 的时候,样本中要加抑肽酶?

抑肽酶(Aprotinin),又称为抑蛋白酶肽,是一种竞争性、可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可与丝氨酸蛋白酶形成稳定复合物并阻断酶的活性位点,抑制糜蛋白酶、胰蛋白酶、激肽释放酶和血纤维蛋白溶酶,降低底物分解速度。在ELISA Kit中广泛的用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解。

2.       为什么要检测总GLP-1 和活性GLP-1

    人胰高血糖素类多肽-1(GLP-1)是天然前原胰高血糖素 preproglucagon 蛋白的组成部分。临床试验表明在 2 型糖尿病用磺酰类降糖药无效的病人中,外源性给予 GLP-1 可有效地降低血浆葡萄糖浓度,短暂升高胰岛素和C-肽浓度。对肥胖老年 2型糖尿病 , 特别是胰岛素抗性患者, GLP-1 有降血糖、降糖化血红蛋白、果糖胺, 增加胰岛素受体敏感性等有益作用。

    GLP-1(1-37) 是无活性的肽链,需进一步水解切除6 个氨基酸,成为具有生物活性的 GLP-1(7-37) ,其中一部分分子 C-端的一个氨基酸被分解,余端被酰胺化为具有生物活性的 GLP-1(7-36) 酰胺。GLP-1与胰高血糖素有50%的同源性,由30 个氨基酸残基组成的蛋白。GLP-1 的空间构象与胰高血糖素相似,其N-端区域具有结合 GLP-1 受体和促进胰岛素合成、释放的作用; C-端区域不具有结合 GLP-1 受体的功能,促胰岛素释放作用极弱。

3.       检测总GLP-1和活性GLP-1 时样本的收集有何不同? 为什么?

检测活性GLP-1时需要加入DPP IV抑制剂,因为GLP-1的两种活化形式GLP 1(7-37)GLP 1(7-36) amide稳定性较低,非常容易被内源性DPP IV所降解。Active GLP-1 ELISA Kit 的抗体只检测GLP 1(7-37)GLP 1(7-36) amide两种形态,加入DPP IV抑制剂可保持两种活化形态的稳定性。而检测总GLP-1则不需加DPP IV抑制剂,因为Total GLP-1 ELISA Kit 的抗体可以检测所有类型的GLP-1

4.       检测糖尿病的动物模型一般是什么样的?为什么糖尿病试剂盒对样本量和灵敏度的要求比较高?

动物模型一般选择小鼠或大鼠。由于糖尿病相关指标的检测通常是动态检测各时期表达情况,并且建模动物一般为老鼠,所以在不影响建模动物正常生理状态下,每次所取的样品数量有限。另外,在糖尿病指标检测的同时还要需要检测建模动物的血糖指标,所以使得这一类ELISA检测的样本量非常少,相应的其ELISA Kit就需要非常高的灵敏度。

5.  GLP-1活性和非活性之间的区别?DPP IV是如何作用于GLP-1

A. Glucagon胰高血糖素——血糖增加。

B. GLP-1glucagon-like peptide胰高血糖素样肽——抑制胰高血糖素分泌,血糖降低。

GLP-12种生物活性形式,分别为GLP-1(7-37)GLP-1 (7-36)酰胺,其氨基酸序列:

GLP-1:            hdeferhaegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg

GLP 1(7-37):            haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg

GLP 1(7-36) amide:       haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-NH2

这两者仅有一个氨基酸序列不同,GLP-180%的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺;

C. DPP IV dipeptidyl peptidase二肽基肽酶——降解GLP-1,失去活性,血糖增加。其作用原理是将氨基末端第2个氨基酸为丙氨酸(Ala)或脯氨酸(Pro)的寡肽的氨基末端前两个氨基酸剪切去除。使得两种活性形态GLP 1(7-36) amide 变为GLP-1(9-36)amideGLP 1(7-37)变为GLP 1(9-37)而失去活性。

D. DPP IV抑制剂——抑制DPP IV,血糖降低。

 

6. 检测glucogan的话,需要样本处理么?

mercodiacrystalchemglucogan试剂盒,样品可以直接进行ELISA 实验;millipore 试剂盒中,因为试剂盒的灵敏度比较低,样本用量比较大(至少150ul),并且有非常复杂的样本处理:5步样本处理,需要用到乙腈,以及氮气干燥等实验步骤,增加了样品处理的复杂度,降低了实验的可靠性。

 

品牌

样本量

样本类型

检测限

反应时间

价格

Millipore

至少150ul,需要复杂的样本前处理

血清,血浆

0.02 - 2 ng/mL

 

便宜

Crystalchem

100ul 小鼠 大鼠50ul

血浆(要求加入抑肽酶,放入EDTA抗凝管中)

50- 10,000 pg/mL

20-24

hours

中等

mercodia

人 大鼠,小鼠,25ul

血清,细胞培养物和血浆(血浆放入抗凝管中,加入DDP4处理)

5-414 pg/mL

18-22

hours

 

四、附录:不同公司的样品处理步骤

公司:Shibayagi

产品:Insulin ELISA Kit Leptin ELISA Kit

样品准备:1. 样品好现提现用,或-35度保存几天之内,解冻的样品需充分混匀后使用。

          2. 溶血和血脂含量过高的样品不宜使用。若需长时间保存,快速冷冻于-35度冰箱,防止反复冻融。

          3. 样品在2-8度时其中的胰岛素处于稳定状态,储存时还需加终浓度100-500 KIU/ml的抑肽素。

产品详情:国产品牌,货号A8260,规格5mg1mg>4500KIU,价格260

储存方式:贮存液5mg500ul 水复溶,终浓度10mg/mlpH7-8

储存条件:2-8

使用方法:1ml 血清或抗凝血浆中加入10ul5mg可处理50ml样品

产品:C-peptide ELISA Kit

样品准备:1. 样品好现提现用,或-35度保存几天之内,解冻的样品需充分混匀后使用。

          2. 溶血和血脂含量过高的样品不宜使用。若需长时间保存,快速冷冻于-35度冰箱,防止反复冻融。

          3. 样品在2-8度时其中的胰岛素处于稳定状态,储存时还需加终浓度100-500KIU/ml的抑肽素,终pH范围为6.5-7.5

 

公司:CRYSTAL CHEM

产品:Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit

样品准备:1. 血浆收集:收集血液后加入抗凝剂(终浓度1 unit/mL肝素,0.1% EDTA0.76% 柠檬酸钠)42000g离心20min

          2. 血清收集:收集血液,待血液凝集完全后42000g离心20min

产品:Rat Adiponectin ELISA Kit

样品准备:1. 血浆收集:收集血液后加入抗凝剂(终浓度1 unit/mL肝素或0.1% EDTA42000g离心20min

          2. 血清收集:收集血液,待血液凝集完全后42000g离心20min

          3. 样品可在室温保存2d-20度保存2年。

产品:Rat GLP-1 ELISA Kit

样品准备: 1. 血浆收集:收集血液后加入1 mg/mL EDTA-2Na抗凝剂42000g离心20min

          2. 血清收集:收集血液,待血液凝集完全后42000g离心20min

          3. 样品保存于-70度,防止反复冻融。

 

公司:Mercodia

产品:Glucagon ELISA Kit

样品准备:1. 血清收集:静脉穿刺取血,待血液凝集完全后离心。避免将样品置于室温或2-8度超过2h,长期保存于-80度,避免反复冻融。

          2. 血浆收集:静脉穿刺取血,收集管中加入EDTA抗凝剂,离心。避免将样品置于室温或2-8度超过2h,长期保存于-80度,避免反复冻融。若使用BD P800收集管(抗凝收集管),样品稳定性会提高20-30%,室温可放置6h2-8度可反复冻融4次。

          3. 加抑肽酶并不会增加样品稳定性。

          4. 细胞培养液:注意培养液中的化学成分可能会影响到分析结果,例如NaN3B-巯基乙醇。

产品:Insulin ELISA Kit

样品准备:1. 血清收集:静脉穿刺取血,待血液凝集完全后离心。

          2. 血浆收集:静脉穿刺取血,收集管中加入肝素或EDTA抗凝剂,离心。

          3. 样品保存在2-8度可保存24h,长期保存于-20度,避免反复冻融。

 

公司:Milliproe

产品:GLP-1 Total ELISA Kit Rat/Mouse Insulin ELISA Kit

样品准备:1. 血清收集:将收集的血液于离心管中室温凝集30min2000-3000g4度离心15min。长期保存于-70度。

          2. 血浆收集:收集血液,加入终浓度1.735mg/ml K3EDTA,离心。长期保存于-70度。

产品:GLP-1 (Active) ELISA Kit

样品准备:1. 血浆收集:收集的血液需30s内置于含有EDTA的收集管中,按照产品指示加入所需量的DPP-IV抑制剂

产品详情:Milliproe,货号DPP4,规格1mL,价格555

储存条件:4

使用方法:每毫升血浆需加10ulDPP-IV

 

2. 41000g离心10min,样品于4度可保存3h,长期保存于-70度,避免反复冻融。

 

 

Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA 比较

小鼠超敏胰岛素ELISA

CRYSTAL CHEM(超敏)

Mercodia(超敏)

ALPCO(超敏)

Shibayagi(超敏)

MILLIPORE(大小鼠通用)

 

90080

10-1249-01

80-INSMSU-E01

AKRIN-031

EZRMI-13K

样本类型

血清、血浆、体液

血清、血浆

血清、血浆

血清、血浆

血清、血浆

样本用量

5 µL

25 μl

5 µL, 25 µL

5 µL

10 μL

样本收集

溶血测试20mg/ml无影响

血浆样本使用肝素/EDTA抗凝管

无要求

加抑肽酶

血浆使用K3EDTA抗凝管收集

检测线

0.1 - 6.4 ng/mL                     0.1 - 12.8 ng/mL                     1 - 64 ng/mL

0.025 - 1.5 µg/l

0.025 - 6.9 ng/mL   0.188 - 6.9 ng/mL

39 - 2,500 pg/ml

0.210 ng/mL

孵育时间

2h

2h

2.5h

2h

3h

 

品牌

产品名称

货号

样本用量

检测范围

Shibayagi

Mouse Insulin ELISA KIT(超敏)

AKRIN-031

5 µL

39 - 2,500 pg/ml

Mouse Insulin ELISA KIT(普敏)

AKRIN-011T

10 μL

156-10,000 pg/ml

Mouse Insulin ELISA KIT (宽范围)

AKRIN-011H

10 μL

0.5 - 100ng/ml

Rat Insulin ELISA KIT(超敏)

AKRIN-031

10 μL

39 - 2,500 pg/ml

Rat Insulin ELISA KIT(普敏)

AKRIN-010T

10 μL

156 - 10,000 pg/ml

Rat Insulin ELISA KIT (宽范围)

AKRIN-010H

10 μL

0.5 - 100ng/ml

Mouse C-peptide ELISA KIT (超敏)

AKRCP-031

10 µL

46.9 - 3,000 pg/ml

Rat C-peptide ELISA KIT (超敏)

AKRCP-030

10 µL

46.9 - 3,000 pg/ml

Mouse Leptin ELISA KIT

AKRLP-011

10 μL

20.6 - 5,000 pg/ml

GLP-1(Active) ELISA KIT

AKMGP-011

50 µL

1.56 - 50 pg/ml

Crystal Chem

Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit

90080

5 µl-100 µl 

0.1 - 6.4 ng/mL

0.1 - 12.8 ng/mL

1 - 64 ng/mL

Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA Kit

90060

5 µl-100 µl

0.1 - 6.4 ng/mL

0.1 - 12.8 ng/mL

1 - 64 ng/mL

Rat Insulin ELISA Kit(普敏)

90010

5 µL

0.156 - 10.0 ng/mL

20 µl

0.039 - 2.5 ng/mL

Mouse Leptin ELISA Kit

90030

5 µL

0.2 - 12.8 ng/mL

Rat Leptin ELISA Kit

90040

5 µL

0.2 - 12.8 ng/mL

Human Adiponectin ELISA Kit

80571

10 µL

2 - 100 ng/ml

Mouse Adiponectin ELISA Kit

80569

5 µL

0.25 - 10 ng/ml

Rat Adiponectin ELISA Kit

80570

5 µL

0.25 - 10 ng/ml

Human IGF-1 ELISA Kit

80572

10 µL

2 - 50 ng/ml

Mouse IGF-1 ELISA Kit

80574

5 µL

0.5 - 18 ng/ml

Rat IGF-1 ELISA Kit

80573

5 µL

0.5 - 18 ng/ml

Human  GLP-1 ELISA Kit

81506

25 µL

1.24 300 pM

Rat GLP-1 ELISA Kit

81507

25 µL

1.24 300 pM

Human Glucagon ELISA Kit

81503

50 µL

50 - 10,000 pg/mL

Mouse Glucagon ELISA Kit

81504

50 µL

50 - 10,000 pg/mL

Rat Glucagon ELISA Kit

81505

50 µL

50 - 10,000 pg/mL

Active GIP ELISA Kit

81509

50 µL

3.9 - 250 pg/mL

Mercodia

Human/Mouse/Rat Glucagon ELISA

10-1271-01

25 μL

5-414 pg/mL

Human/Mouse/Rat Glicentin ELISA

10-1273-01

25 μL

24-2400 pg/mL

Human Ultrasensitive Insulin ELISA

10-1132-01

25 μL

0.15 - 20 mU/L

Human Insulin ELISA(普敏)

10-1113-01

25 μL

3 - 200 mU/L

Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA

10-1249-01

25 μl

25 - 1500 pg/mL

Mouse Insulin ELISA(普敏)

10-1247-01

10 μL

200 6500 pg/mL

Ultrasensitive Rat Insulin ELISA

10-1251-01

25 μL

20 1000 pg/mL

Rat Insulin ELISA(普敏)

10-1250-01

10 μL

150 5500 pg/mL

Human Leptin ELISA

10-1199-01

25 μL

100 - 5000 ng/mL

Human Adiponectin ELISA

10-1193-01

25 μL

5 - 300 ng/mL

Human C-peptide ELISA

10-1136-01

25 μl

100 - 4000 pmol/L

Rat C-peptide ELISA

10-1172-01

10 μL

100 - 4000 pmol/L

 

 

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