样品处理汇总表
注：以下汇总了国际主流的糖尿病检测试剂盒的品牌如：日本shibayaji，美国crystalchem，merck millipore，美国ALPCO, 瑞典mercodia；
一、 样本基本处理方式:
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样本类型
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General Protocol
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作用
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部分试剂盒推荐
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血清
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静脉穿刺取血，待血液凝集完全后离心
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样本基本收集方式，不加抑肽酶也可，但样本容易降解
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CRYSTAL CHEM insulin，mercodia insulin，Alpco insulin，Millipore insulin
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血浆
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静脉穿刺取血，加入抗凝剂（肝素、EDTA、柠檬酸钠）离心，推荐用EDTA 和柠檬酸钠
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血清，血浆+抑肽酶
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1ml 血清或抗凝血浆中加入10ul
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储存样品时加入抑肽酶可提高样品稳定性（可以作为insulin 样本收集的基本方法）
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例如：Shibayagi- Insulin ELISA Kit， Leptin ELISA Kit, 其他糖尿病检测试剂盒（除活性GLP-1 检测）
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血清，血浆+抑肽酶+DPP-IV抑制剂
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每毫升血浆需加10ul DPP-IV
可检测活性Active –GLP-1
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采集血浆时加入DPP-IV抑制剂可以提高 活性GLP-1的稳定性
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Milliproe- GLP-1 (Active) ELISA Kit Shibayagi- GLP-1 (Active) ELISA Kit
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抗凝管
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采集血浆时使用抗凝管可减少血液凝血（也可不用）
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非必需
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Mercodia- Glucagon ELISA Kit ，CRYSTAL CHEM- Rat GLP-1 ELISA Kit
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二、 样品稳定剂的使用方法：
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A. 抑肽酶Aprotinin
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B．DPP_IV抑制剂
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C. P800抗凝管
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品牌
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国产品牌
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Millipore
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Becton Dickinson
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货号
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A8260
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DPP4
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36642
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规格
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5mg
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1mL
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100个
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储存
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贮存液：5mg用500ul 水复溶，终浓度10mg/ml，pH7-8，4℃
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4℃
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密封保存
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使用方法
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1ml 血清或抗凝血浆中加入10ul，5mg可处理50ml样品
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每毫升血浆需加10ul DPP-IV
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采集血浆时收集血液
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三、 糖尿病检测的常规问题：
1. 为什么检测insulin 的时候，样本中要加抑肽酶？
抑肽酶（Aprotinin），又称为抑蛋白酶肽，是一种竞争性、可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可与丝氨酸蛋白酶形成稳定复合物并阻断酶的活性位点，抑制糜蛋白酶、胰蛋白酶、激肽释放酶和血纤维蛋白溶酶，降低底物分解速度。在ELISA Kit中广泛的用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解。
2. 为什么要检测总GLP-1 和活性GLP-1？
人胰高血糖素类多肽-1(GLP-1)是天然前原胰高血糖素 preproglucagon 蛋白的组成部分。临床试验表明在 2 型糖尿病用磺酰类降糖药无效的病人中,外源性给予 GLP-1 可有效地降低血浆葡萄糖浓度,短暂升高胰岛素和C-肽浓度。对肥胖老年 2型糖尿病 , 特别是胰岛素抗性患者, GLP-1 有降血糖、降糖化血红蛋白、果糖胺, 增加胰岛素受体敏感性等有益作用。
GLP-1(1-37) 是无活性的肽链，需进一步水解切除6 个氨基酸，成为具有生物活性的 GLP-1(7-37) ，其中一部分分子 C-端的一个氨基酸被分解，余端被酰胺化为具有生物活性的 GLP-1(7-36) 酰胺。GLP-1与胰高血糖素有50%的同源性，由30 个氨基酸残基组成的蛋白。GLP-1 的空间构象与胰高血糖素相似，其N-端区域具有结合 GLP-1 受体和促进胰岛素合成、释放的作用; C-端区域不具有结合 GLP-1 受体的功能，促胰岛素释放作用极弱。
3. 检测总GLP-1和活性GLP-1 时样本的收集有何不同？ 为什么？
检测活性GLP-1时需要加入DPP IV抑制剂，因为GLP-1的两种活化形式GLP 1(7-37)和GLP 1(7-36) amide稳定性较低，非常容易被内源性DPP IV所降解。Active GLP-1 ELISA Kit 的抗体只检测GLP 1(7-37)和GLP 1(7-36) amide两种形态，加入DPP IV抑制剂可保持两种活化形态的稳定性。而检测总GLP-1则不需加DPP IV抑制剂，因为Total GLP-1 ELISA Kit 的抗体可以检测所有类型的GLP-1。
4. 检测糖尿病的动物模型一般是什么样的？为什么糖尿病试剂盒对样本量和灵敏度的要求比较高？
动物模型一般选择小鼠或大鼠。由于糖尿病相关指标的检测通常是动态检测各时期表达情况，并且建模动物一般为老鼠，所以在不影响建模动物正常生理状态下，每次所取的样品数量有限。另外，在糖尿病指标检测的同时还要需要检测建模动物的血糖指标，所以使得这一类ELISA检测的样本量非常少，相应的其ELISA Kit就需要非常高的灵敏度。
5. GLP-1活性和非活性之间的区别？DPP IV是如何作用于GLP-1？
A. Glucagon胰高血糖素——血糖增加。
B. GLP-1glucagon-like peptide胰高血糖素样肽——抑制胰高血糖素分泌，血糖降低。
GLP-1有2种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1 (7-36)酰胺，其氨基酸序列：
GLP-1: hdeferhaegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg
GLP 1(7-37): haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg
GLP 1(7-36) amide: haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-NH2
这两者仅有一个氨基酸序列不同，GLP-1约80%的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺；
C. DPP IV dipeptidyl peptidase二肽基肽酶——降解GLP-1，失去活性，血糖增加。其作用原理是将氨基末端第2个氨基酸为丙氨酸（Ala）或脯氨酸（Pro）的寡肽的氨基末端前两个氨基酸剪切去除。使得两种活性形态GLP 1(7-36) amide 变为GLP-1(9-36)amide，GLP 1(7-37)变为GLP 1(9-37)而失去活性。
D. DPP IV抑制剂——抑制DPP IV，血糖降低。
6. 检测glucogan的话，需要样本处理么？
mercodia和crystalchem的glucogan试剂盒，样品可以直接进行ELISA 实验；millipore 试剂盒中，因为试剂盒的灵敏度比较低，样本用量比较大（至少150ul），并且有非常复杂的样本处理：5步样本处理，需要用到乙腈，以及氮气干燥等实验步骤，增加了样品处理的复杂度，降低了实验的可靠性。
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品牌
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样本量
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样本类型
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检测限
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反应时间
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价格
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Millipore
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至少150ul，需要复杂的样本前处理
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血清，血浆
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0.02 - 2 ng/mL
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便宜
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Crystalchem
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人100ul 小鼠 大鼠50ul
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血浆（要求加入抑肽酶，放入EDTA抗凝管中）
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50- 10,000 pg/mL
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20-24
hours
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中等
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mercodia
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人 大鼠，小鼠，25ul
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血清，细胞培养物和血浆（血浆放入抗凝管中，加入DDP4处理）
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5-414 pg/mL
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18-22
hours
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贵
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四、附录：不同公司的样品处理步骤
公司：Shibayagi
产品：Insulin ELISA Kit， Leptin ELISA Kit
样品准备：1. 样品好现提现用，或-35度保存几天之内，解冻的样品需充分混匀后使用。
2. 溶血和血脂含量过高的样品不宜使用。若需长时间保存，快速冷冻于-35度冰箱，防止反复冻融。
3. 样品在2-8度时其中的胰岛素处于稳定状态，储存时还需加终浓度100-500 KIU/ml的抑肽素。
产品详情：国产品牌，货号A8260，规格5mg，1mg>4500KIU，价格260
储存方式：贮存液5mg用500ul 水复溶，终浓度10mg/ml，pH7-8
储存条件：2-8℃
使用方法：1ml 血清或抗凝血浆中加入10ul，5mg可处理50ml样品
产品：C-peptide ELISA Kit
样品准备：1. 样品好现提现用，或-35度保存几天之内，解冻的样品需充分混匀后使用。
2. 溶血和血脂含量过高的样品不宜使用。若需长时间保存，快速冷冻于-35度冰箱，防止反复冻融。
3. 样品在2-8度时其中的胰岛素处于稳定状态，储存时还需加终浓度100-500KIU/ml的抑肽素，终pH范围为6.5-7.5。
公司：CRYSTAL CHEM
产品：Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit
样品准备：1. 血浆收集：收集血液后加入抗凝剂（终浓度1 unit/mL肝素，0.1% EDTA或0.76% 柠檬酸钠），4度2000g离心20min。
2. 血清收集：收集血液，待血液凝集完全后4度2000g离心20min。
产品：Rat Adiponectin ELISA Kit
样品准备：1. 血浆收集：收集血液后加入抗凝剂（终浓度1 unit/mL肝素或0.1% EDTA），4度2000g离心20min。
2. 血清收集：收集血液，待血液凝集完全后4度2000g离心20min。
3. 样品可在室温保存2d，-20度保存2年。
产品：Rat GLP-1 ELISA Kit
样品准备： 1. 血浆收集：收集血液后加入1 mg/mL EDTA-2Na抗凝剂，4度2000g离心20min。
2. 血清收集：收集血液，待血液凝集完全后4度2000g离心20min。
3. 样品保存于-70度，防止反复冻融。
公司：Mercodia
产品：Glucagon ELISA Kit
样品准备：1. 血清收集：静脉穿刺取血，待血液凝集完全后离心。避免将样品置于室温或2-8度超过2h，长期保存于-80度，避免反复冻融。
2. 血浆收集：静脉穿刺取血，收集管中加入EDTA抗凝剂，离心。避免将样品置于室温或2-8度超过2h，长期保存于-80度，避免反复冻融。若使用BD P800收集管（抗凝收集管），样品稳定性会提高20-30%，室温可放置6h，2-8度可反复冻融4次。
3. 加抑肽酶并不会增加样品稳定性。
4. 细胞培养液：注意培养液中的化学成分可能会影响到分析结果，例如NaN3和B-巯基乙醇。
产品：Insulin ELISA Kit
样品准备：1. 血清收集：静脉穿刺取血，待血液凝集完全后离心。
2. 血浆收集：静脉穿刺取血，收集管中加入肝素或EDTA抗凝剂，离心。
3. 样品保存在2-8度可保存24h，长期保存于-20度，避免反复冻融。
公司：Milliproe
产品：GLP-1 Total ELISA Kit， Rat/Mouse Insulin ELISA Kit
样品准备：1. 血清收集：将收集的血液于离心管中室温凝集30min，2000-3000g，4度离心15min。长期保存于-70度。
2. 血浆收集：收集血液，加入终浓度1.735mg/ml K3EDTA，离心。长期保存于-70度。
产品：GLP-1 (Active) ELISA Kit
样品准备：1. 血浆收集：收集的血液需30s内置于含有EDTA的收集管中，按照产品指示加入所需量的DPP-IV抑制剂
产品详情：Milliproe，货号DPP4，规格1mL，价格555
储存条件：4℃
使用方法：每毫升血浆需加10ulDPP-IV
2. 4度1000g离心10min，样品于4度可保存3h，长期保存于-70度，避免反复冻融。
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Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA 比较
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小鼠超敏胰岛素ELISA
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CRYSTAL CHEM（超敏）
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Mercodia（超敏）
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ALPCO（超敏）
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Shibayagi（超敏）
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MILLIPORE（大小鼠通用）
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货 号
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90080
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10-1249-01
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80-INSMSU-E01
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AKRIN-031
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EZRMI-13K
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样本类型
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血清、血浆、体液
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血清、血浆
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血清、血浆
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血清、血浆
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血清、血浆
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样本用量
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5 µL
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25 μl
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5 µL, 25 µL
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5 µL
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10 μL
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样本收集
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溶血测试20mg/ml无影响
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血浆样本使用肝素/EDTA抗凝管
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无要求
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加抑肽酶
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血浆使用K3EDTA抗凝管收集
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检测线
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0.1 - 6.4 ng/mL 0.1 - 12.8 ng/mL 1 - 64 ng/mL
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0.025 - 1.5 µg/l
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0.025 - 6.9 ng/mL 0.188 - 6.9 ng/mL
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39 - 2,500 pg/ml
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0.2–10 ng/mL
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孵育时间
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2h
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2h
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2.5h
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2h
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3h
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品牌
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产品名称
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货号
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样本用量
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检测范围
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Shibayagi
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Mouse Insulin ELISA KIT（超敏）
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AKRIN-031
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5 µL
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39 - 2,500 pg/ml
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Mouse Insulin ELISA KIT(普敏)
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AKRIN-011T
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10 μL
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156-10,000 pg/ml
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Mouse Insulin ELISA KIT (宽范围)
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AKRIN-011H
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10 μL
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0.5 - 100ng/ml
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Rat Insulin ELISA KIT（超敏）
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AKRIN-031
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10 μL
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39 - 2,500 pg/ml
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Rat Insulin ELISA KIT(普敏)
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AKRIN-010T
|
10 μL
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156 - 10,000 pg/ml
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Rat Insulin ELISA KIT (宽范围)
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AKRIN-010H
|
10 μL
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0.5 - 100ng/ml
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Mouse C-peptide ELISA KIT (超敏)
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AKRCP-031
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10 µL
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46.9 - 3,000 pg/ml
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Rat C-peptide ELISA KIT (超敏)
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AKRCP-030
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10 µL
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46.9 - 3,000 pg/ml
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Mouse Leptin ELISA KIT
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AKRLP-011
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10 μL
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20.6 - 5,000 pg/ml
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GLP-1(Active) ELISA KIT
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AKMGP-011
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50 µL
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1.56 - 50 pg/ml
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Crystal Chem
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Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit
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90080
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5 µl-100 µl
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0.1 - 6.4 ng/mL
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0.1 - 12.8 ng/mL
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1 - 64 ng/mL
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Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA Kit
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90060
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5 µl-100 µl
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0.1 - 6.4 ng/mL
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0.1 - 12.8 ng/mL
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1 - 64 ng/mL
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Rat Insulin ELISA Kit（普敏）
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90010
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5 µL
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0.156 - 10.0 ng/mL
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20 µl
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0.039 - 2.5 ng/mL
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Mouse Leptin ELISA Kit
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90030
|
5 µL
|
0.2 - 12.8 ng/mL
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Rat Leptin ELISA Kit
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90040
|
5 µL
|
0.2 - 12.8 ng/mL
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Human Adiponectin ELISA Kit
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80571
|
10 µL
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2 - 100 ng/ml
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Mouse Adiponectin ELISA Kit
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80569
|
5 µL
|
0.25 - 10 ng/ml
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Rat Adiponectin ELISA Kit
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80570
|
5 µL
|
0.25 - 10 ng/ml
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Human IGF-1 ELISA Kit
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80572
|
10 µL
|
2 - 50 ng/ml
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Mouse IGF-1 ELISA Kit
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80574
|
5 µL
|
0.5 - 18 ng/ml
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Rat IGF-1 ELISA Kit
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80573
|
5 µL
|
0.5 - 18 ng/ml
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Human GLP-1 ELISA Kit
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81506
|
25 µL
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1.24 – 300 pM
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Rat GLP-1 ELISA Kit
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81507
|
25 µL
|
1.24 – 300 pM
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Human Glucagon ELISA Kit
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81503
|
50 µL
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50 - 10,000 pg/mL
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Mouse Glucagon ELISA Kit
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81504
|
50 µL
|
50 - 10,000 pg/mL
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Rat Glucagon ELISA Kit
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81505
|
50 µL
|
50 - 10,000 pg/mL
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Active GIP ELISA Kit
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81509
|
50 µL
|
3.9 - 250 pg/mL
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Mercodia
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Human/Mouse/Rat Glucagon ELISA
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10-1271-01
|
25 μL
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5-414 pg/mL
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Human/Mouse/Rat Glicentin ELISA
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10-1273-01
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25 μL
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24-2400 pg/mL
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Human Ultrasensitive Insulin ELISA
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10-1132-01
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25 μL
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0.15 - 20 mU/L
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Human Insulin ELISA（普敏）
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10-1113-01
|
25 μL
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3 - 200 mU/L
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Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA
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10-1249-01
|
25 μl
|
25 - 1500 pg/mL
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Mouse Insulin ELISA（普敏）
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10-1247-01
|
10 μL
|
200 – 6500 pg/mL
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Ultrasensitive Rat Insulin ELISA
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10-1251-01
|
25 μL
|
20 – 1000 pg/mL
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Rat Insulin ELISA（普敏）
|
10-1250-01
|
10 μL
|
150 – 5500 pg/mL
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Human Leptin ELISA
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10-1199-01
|
25 μL
|
100 - 5000 ng/mL
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Human Adiponectin ELISA
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10-1193-01
|
25 μL
|
5 - 300 ng/mL
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Human C-peptide ELISA
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10-1136-01
|
25 μl
|
100 - 4000 pmol/L
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Rat C-peptide ELISA
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10-1172-01
|
10 μL
|
100 - 4000 pmol/L
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