Introduction

本实验是检测蛋白的定性及半定量的技术方法；

实验步骤概述：

1.       确认目的蛋白信息，订购或提供相应一抗；

2.       存于液氮中的组织或细胞用蛋白裂解液（含PMSF，若有磷酸化蛋白，则同时含有磷酸酶抑制剂）进行蛋白的提取；

3.       提出的蛋白用BCA系统进行蛋白初定量；

4.       Western预实验（一个靶标蛋白一张膜预跑）；

5.       Western正式实验（优化并固定实验条件，完成所有样本与靶标蛋白）；

6.       判断实验结果，灰度值读取，进行半定量计算；

Antibody

蛋白信息是从NCBI上面查得；

一抗信息根据相应公司货号查询并下载的protocol；

二抗信息如下：Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP (jackson)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP (HRP) (jackson)、Rabbit Anti-Goat IgG(H+L) HRP (jackson )；

常见的抗体公司如下：abcam、Epitomics、Cell signaling、Dako、Sigma、BD、R&D system、Millipore、jackson；

Sample

Ø  样本采集和保存：

尽量新鲜采集样本，及时添加裂解液裂解样本，冰上裂解，样本热变性并加入loading buffer待测，保存温度越低越好。

Ø  从组织或细胞内提取裂解物：

相对于普通裂解液，利用变性程度更强的RIPA缓冲液会更彻底和稳定的裂解组织；超声加上化学裂解能得到非常好的效果；对于组织样品，建议使用匀浆的步骤。

Ø  磷酸化蛋白检测：

使用磷酸化单去污裂解液（RIPA+磷酸酶抑制剂），降低磷酸化蛋白降解风险。

Product

样本制备

电泳转膜

孵育曝光

Material & Methods

实验所用试剂：

1.      PMSF、Tween20、丙稀酰胺、氟化钠、过硫酸胺、甲叉双丙稀酰胺、偏矾酸钠、HCl、NaCl、异丙醇、DTT、TEMED、β-巯基乙醇、甘氨酸、甘油、磺基水杨酸、甲醇、丽春红S 、三氯乙酸、溴酚蓝，国药；

2.      SDS、Tris，Sigma；

3.      脱脂奶粉，Difco；

4.      BSA，Roche；

5.      ECL化学发光试剂，promage；

6.      定影粉、显影粉，柯达；

实验相关仪器：

1.      微型离心机，GyroSpin，GYROZEN；

2.      电热恒温水槽，DK-420，上海精宏实验设备有限公司；

3.      电子天平，ES120，D&T；

4.      12孔高速微量离心机，MicroSmart，北京昊诺斯科技有限公司

5.      电泳仪电源，DYY-7C，北京市六一仪器厂；

6.      电泳仪、转膜仪，DYCZ-40D，北京市六一仪器厂；

7.      X射线摄影暗匣，AX-II，广东粤华医疗器械厂有限公司；

8.      水平摇床，TS-1，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

9.      旋涡混合器，GL-88B，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

10.   迷你水平摇床，MH-1，海门市其林贝尔仪器制造有限公司

11.   恒温金属浴，HB-100，杭州博日科技有限公司；

12.   酶标仪，DNM-9602，北京普朗新科技有限公司；

13.   离心机，TDL-80-2B，飞鸽牌；

14.   超细匀浆器，F6/10-6G，FLUKO（上海）流体机械制造有限公司；

15.   移液器，10ul/200ul/1000ul，Dragonlab；

实验相关耗材：

1.      1.5ml无色离心管，MCT-150-C，Axygen；

2.      200ul 黄吸头，T-200-Y，Axygen；

3.      0.5-10ul 透明Gilson吸头，Axygen；

4.      0.6ml无色离心管，MCT-060-C，Axygen；

5.      96孔酶标板，Nunc；

6.      滤纸，上海实生细胞生物技术有限公司

7.      0.45um NC膜，Millipore，Millipore

8.      抗体4孔孵育槽，Nunc；

实验步骤

第一步、样本预处理：

（1）单层贴壁细胞总蛋白提取：

1.      倒掉培养基，用4℃预冷1*PBS洗3次，注意不要用胰酶消化，也不要把细胞吹下，冰上操作。

2.      每10^6个细胞加200ul单去污剂裂解液（RIPA）（一般6孔板长满1孔细胞，每孔加200ul裂解液，覆盖整个细胞底面即可），用枪头把细胞刮下来，边刮边用移液器吸取裂解液将细胞吹下。

3.      细胞吹下后冰上放置30min裂解，用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中。

4.      收集的细胞样本-20℃冻融一次。

5.      4℃ 12000rpm离心5min。离心完后取上清-80℃保存待用。

（2）悬浮细胞总蛋白提取：

1.      将培养液直接倒入1.5ml离心管，4℃ 1500rpm离心5min，弃上清，如果体积超过1.5ml，可将剩余培养液倒入相对应的离心管，重复离心弃上清的步骤，直到所有细胞被离心收集。

2.      用4℃预冷1*PBS重悬细胞，4℃ 1500rpm离心5min，弃上清，冰上操作。

3.      每10^6个细胞加200ul单去污剂裂解液（RIPA），用移液器吹打混匀，冰上裂解30min。

4.      收集的细胞样本-20℃冻融一次。

5.      4℃ 12000rpm离心5min。离心完后取上清-80℃保存待用。

（3）组织总蛋白提取：

1.      根据组织块大小，基本按照重量体积比1:5加入单去污剂裂解液（RIPA）。

2.      根据组织不同，采取的前期预处理方式不同，如肝脏这类比较块大但不粘稠的组织，可以先用剪刀剪碎，然后用电动匀浆机匀浆；眼角膜之类的比较小，不易用匀浆机匀碎，可用研磨棒研磨；脑干一类比较好处理，可直接用匀浆机匀浆；肌肉或其他粘膜或上皮组织，需要先剪碎，再用研磨棒研磨。（所有处理需在冰上操作）。

3.      冰上放置裂解30min后，用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中。

4.      4℃ 12000rpm离心10min。离心完后取上清-80℃保存待用。

（4）上样样本制备：

1.      使用BCA系统进行蛋白初定量（参照BCA蛋白定量试剂盒说明书）；

2.      利用BCA蛋白定量结果，均一化所有样本总蛋白浓度，即向浓度较高样本中加入适量单去污剂裂解液（RIPA）；

3.      每管样本中加入等量上样缓冲液（loading buffer）；

4.      将样本放入恒温金属浴95℃ 15mins，取出即可上样电泳，或-80℃保存待用；

注意：

1.      Western实验需要足够多的蛋白量以保证实验结果的质量，样本量需细胞多于10^6个，组织湿重大于50mg，匀浆液体积大于100ul且总蛋白浓度大于0.5mg/ml；

2.      高脂肪或糖类组织，组织匀浆或液氮研磨後须4℃ 12000rpm 10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；

3.      Western的蛋白样本制备后，越早进行实验，效果越好，保存时间过长会增加蛋白降解风险；

4.      磷酸化蛋白有丰度低、易降解的特点，做Western实验必须在RIPA中预先加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以保证实验质量。

第二步、电泳制膜：

1.      按目的蛋白大小制取1.0mm分离、浓缩胶，分离胶的配制：10%；

2.      将胶浸没于电泳缓冲液中，向泳道中注入10μg 预处理蛋白样本；

3.      浓缩胶电泳条件80V 30mins，分离胶电泳条件120V 60mins；

4.      将电泳得到的带有蛋白的分离胶按以下顺序叠放：海绵垫、3层滤纸、分离胶、NC膜、3层滤纸、海绵垫，将胶朝向负极、转膜装置浸没于转膜缓冲液中；

5.      小分子蛋白（小于90kDa）转膜条件为4℃ 60V 1.5h，大分子蛋白 (大于90kDa)转膜条件为4℃ 120V 2h；

6.      转膜后，将转膜制得的承载膜先置于TBST中浸润，在丽春红中染色，验证转膜成功后用TBST将丽春红洗脱，进入孵育步骤；

注意：

1.      本实验中使用的承载膜为硝酸纤维素（NC）膜，转膜方式为湿转。

2.      如需测的蛋白分子量大小差距较大，可将膜根据marker剪开，孵育不同的抗体。

3.      在上样时，为了保证电泳质量，两边的泳道以及未上样的泳道会上有loading buffer保护。

来自"http://www.transhold.org/wiki/RT-PCR_%E4%B8%A4%E6%AD%A5%E6%B3%95%E7%9A%84CDNA%E5%90%88%E6%88%90%E5%B8%B8%E7%94%A8%E8%AF%95%E5%89%82%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E%E2%80%94%E2%80%94promega_MMLV"

第三步、封闭孵育曝光、抗体洗脱；

1.      将载有蛋白的承载膜整张浸没于5%脱脂牛奶中，室温摇晃1h。

2.      用TBST稀释一抗，将膜浸没于稀释过的一抗工作液（总体积为2ml）中，4℃孵育过夜或者室温孵育1.5h。

3.      用TBST在摇床上室温清洗已经孵育好一抗的膜，10min*3次。

4.      用TBST稀释二抗，将膜浸没于稀释过的二抗工作液（总体积为2ml）中，室温孵育1 h。

5.      用TBST在摇床上室温清洗已经孵育好二抗的膜，10min*3次。

6.      将膜从TBST中取出，放在平整的位置，向膜上滴加ECL发光液，将膜移至曝光袋中（防止ECL直接接触X光片）。

7.      在暗室中，将曝光袋放入X射线摄影暗匣内，再放上合适大小的X光片，关上曝光匣开始曝光。曝光结束后，取出X光片，在显影液中浸泡3分钟，稍加沥干，置于定影液中放置3分钟。将曝光完成的X光片在水下冲洗，至无定影液残留，此时X光片上相应位置的黑色条带即为终结果。

8.      经过抗体孵育、曝光后的膜可用抗体洗脱液洗脱抗体。将膜放入抗体洗脱液，在50℃水浴中，手动搅拌5分钟，静置10分钟，重复3次。

9.      抗体洗脱后的膜需从封闭重新开始，孵育一抗、二抗、曝光。

注意：

1.      实验中本公司提供内参β-actin、GPADH一抗以及抗兔、小鼠、山羊二抗抗体，目的蛋白抗体或特殊种属二抗由客户提供。

2.      WB终实验结果与一抗质量及样本有密切关系，实验中技术员会根据曝光结果调整一抗稀释比及上样量，如终结果不佳是由客户提供的一抗质量或样本较差所致，本公司概不负责。

3.      实验中的一般曝光条件为1min、5mins、1h，取效果佳的一张；根据曝光的结果，此条件可适当调整。

4.      抗体洗脱为正常实验步骤，可能会洗去部分蛋白，但在多数情况下并不影响实验结果，但不建议多次反复进行抗体洗脱，以免影响后续实验质量。

5.      TBST洗膜的步骤可根据具体情况适当调整洗膜时间与次数。

Discussion：

一、预处理前的准备工作：

蛋白酶非常稳定，是导致蛋白降解主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使蛋白酶完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与蛋白制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

蛋白酶的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

处理样本时尽可能使用无菌，一次性塑料制品，如果没有开封使用过，通常没有必要再次处理。

二、电泳制膜说明：

将处理过的样本蛋白在PAGE胶中电泳，通过分离胶的分子筛作用得到不同分子量大小的蛋白，并将电泳得到的蛋白原位转移至承载膜上。

三、封闭孵育曝光、抗体洗脱说明：

用5%脱脂牛奶将承载膜上多余的蛋白承载位点封闭，浸润于稀释过的一抗中，通过抗体和抗原的特异性结合，使一抗与样本蛋白中的相应抗原结合，洗去多余一抗，再将膜浸润与稀释过的二抗中，使二抗（含有HRP）与一抗（此时为抗原）结合，洗去多余二抗，在膜上滴加适量ECL发光液，ECL发光液在HRP的作用下发出荧光，可被X光片吸收成像。曝光成像后X光片上的相应位置的黑色条带即为后结果。在一个蛋白完成后，可通过抗体洗脱液将结合在蛋白上的一抗、二抗洗去，再次孵育一个抗体。

四、数据分析部分：

后曝光所得的X光片会经过扫描机扫描，由技术员截图，并经过图像软件得到去除背景的灰度图像，由电脑计算目的条带的阴影面积得到数值，并由技术员做出数据报告。