1．检查仪器及试剂

    检查各仪器是否完好可用，各试剂是否在使用期限内，各耗材是否准备充分。

2. 样本前处理及蛋白定量

   将保存好的样本（注意避免反复冻融）取出，用剪刀和镊子将其剪成实验所需大小，置于离心管中，在管壁上标识样本名称，注意取不同样本时的取样工具要在PBS中清洗，避免交叉污染，在天平上称量样品重量，记录，根据所称重量加入5倍体积的单去污裂解液，用电动匀浆机进行匀浆，在匀浆不同样本时要在PBS中清洗，避免交叉污染，匀浆后在离心机中12000转离心15分钟，取上清液测定蛋白浓度，（注意要尽快测蛋白浓度防止降解），测定用BCA试剂盒，做法依说明书所示。

3. 蛋白变性

将测好蛋白浓度的样本进行均一化处理，按照测量蛋白浓度的结果，以样本中小蛋白含量为参照值，拉平所有样本蛋白浓度，计算在16ul体系下需要加的样本和补足的缓冲液的体积数，（若需要多次试验则准备160ul体系的各体积数），置于90℃金属浴中15分钟。变性结束后，及时保存好样本，供后续试验使用。

4. 电泳

4.1配胶

    将配胶用的玻璃板置于有洗涤剂的清水中（每周一换）用棉条轻轻擦拭（不可用布，防止划伤玻璃），洗好后用清水冲干净，标准是在玻璃板面上有凝聚的水珠而非大滩的水渍，在操作台上铺一层纸巾，将两块玻璃板放在纸巾上，互相结合面朝上，用吹风机吹干板上水珠，若有残留，用纸巾将水珠点干，避免大面积擦拭划伤玻璃。

   手持已经干燥的玻璃板，注意手持玻璃板边缘，将其重合好后，置于制胶器中，用楔子固定，注意观察两玻璃底面与制胶器底部是否水平，缝合良好，将做好的制胶器置于制胶架上，（制胶架擦拭干净），固定时将两侧的固定轴同时往里挤压，然后双手同时顺时针转动至所需标的角度上（1.0mm的胶转至1.0mm刻度以此类推），听到双手转至咔的一声，固定结束。

   配置分离胶，按照试剂配置表，准备好相应的试剂，注意试剂的保存条件，配胶时要迅速，防止时间过长凝胶，若温度过低导致试剂沉淀，凝结，则需在37℃水浴中将其混合均匀，配好后，用900ul的枪在一面玻璃板上加5枪，注意加的时候要缓慢加，避免漏胶，避免混入气泡，然后用枪在板面各处滴加水滴压胶，至与板面水平，制好后等待20分钟以便凝胶，若温度过低，需要置于室温20℃环境中凝胶，或者延长凝胶时间。

   将板面的水层倾倒，用滤纸吸干残留的水滴，注意不要和分离胶接触，以免发生粘连。配置浓缩胶要求同上，在配好后迅速插入上样梳，注意插好后不要太用力，等待凝胶时间和温度过低时处理方式亦同上。凝胶后一定要在制胶槽中充入电泳液再拔梳子，否则拔得时候上样孔会扭曲，拔梳子时，双手同时捏住梳子的两端，同时轻轻往上拔，用力要均匀一致，避免产生气泡，若拔的过程中，凝胶不好，可能是由于配浓缩胶所用AP或TEMD不准，需要重配，这一步一定很谨慎，否则做不好会导致重来浪费时间，后续的操作都要依次后推。

4.2上样 

    事先将每块胶的泳道上样的排版排好，一般一块胶上8个样本，不同客户的样本用loading隔开，若排不满15个泳道，其余空的泳道用loading隔开，一般样本上16ul体系，loading上4ul，marker上3ul体系，加样的时候，枪头注意不要插入上样槽很深，注意加样不要溢出。若上4块胶或更多时，要注意一定要等所有的胶全部制好才能上样，否则溴酚蓝在缓冲液中时间过长会导致溢出。

电泳，在电泳槽中充满电泳缓冲液，电泳液不要过满，注意接头处要保持干燥避免短路，电泳仪调至80v跑30-45分钟，待在浓缩胶中将蛋白拉到同一水平线上，转到120v，共跑一个半小时。注意要把marker分子量小的蛋白跑出来。有的电泳中蛋白阻力比较大，一个半小时可能还没有把分子量小的蛋白跑出来，要延长电泳时间，直到跑出。

5. 转膜

  准备一个水槽，充入转膜缓冲液，将电泳结束后的电泳装置拆开，把玻璃板取出在清水下冲一下，双手抵住玻璃板将结合部位撬开，注意一定要动作柔和，防止胶碎，用小铲子将胶和玻璃贴合面轻轻划痕，把浓缩胶的部分弃掉，分离胶的部分用铲子轻轻铲出放在有转膜缓冲液的水槽中，取三张滤纸重叠好，浸入转膜缓冲液，取一张转膜的nc膜，注意用镊子取夹，避免接触到nc膜表面，浸入转膜缓冲液中，将胶按照上样的顺序平置于掌心中，上面垫一层nc膜，注意覆盖完全，再在上面一层垫三层滤纸，取一层浸了转膜缓冲液的棉垫，在胶的下层同样放置浸了转膜缓冲液的滤纸和棉垫，将“整个三明治 ”放在水槽中，用铲子水平赶走气泡，注意要记住胶在上面还是膜在上面，将胶的一面放在转膜夹的黑色一面，插好后充入转膜缓冲液，转膜电压60v，在4℃下转膜一个半小时。

6. 染膜

  将转膜结束的装置拆开，用镊子取出nc膜，放入TBST中，其余棉垫清洗后回收使用，滤纸以及胶弃掉，胶有毒注意妥善处理。按照丽春红溶液：双蒸水1：10配置染膜溶液，混匀。用镊子夹取nc膜放入染膜溶液中浸没，三分钟后放入清水中清洗，观察染膜结果，目的蛋白是否在准确的位置上。用剪刀剪下目的蛋白区域的膜，注意要用镊子避免接触到蛋白，剪膜的时候注意避免接触到目的蛋白，在膜的边缘无蛋白区标识可识别的标志。

7. 封闭

  脱脂牛奶0.5g，加到TBST 50ml中，现配现用，将剪好的nc膜放在封闭液中，注意不要将膜层叠在一起，在脱色摇床上以一定的速率进行封闭一个小时。

8. 一抗

  将一抗按照说明书上的稀释比进行稀释，若预实验效果不好，进行梯度稀释，注意样本和抗体的种属是否匹配，注意抗体不要长时间置于外面，用完后及时将其放入冰箱中，将抗体从冰箱中取出，进行混匀离心，计算样本所需要的抗体量，用TBST进行稀释，稀释混匀注意不要用加样枪吹打避免产生气泡，抗体稀释液一般加2ml，将nc膜用镊子将有蛋白的一面孵到抗体稀释液中，放入4℃冰箱中过夜。

9. 洗脱

  将孵育好的nc膜从孔槽中取出，放入装有TBST的平皿中，脱色摇床以固定转速清洗10分钟，三次。注意膜不要层叠在一起。

10. 二抗

  将二抗从冰箱中取出，混匀离心，计算样本所需要抗体量。用TBST稀释，注意若按照稀释比，抗体的量少于1ul，则要按照至少1ul的量来计算所需的TBST的量，放入孔槽中孵育一个小时。因大多数样本的二抗是固定几种，因此计算中总的二抗需用量，在离心管中进行稀释，稀释时注意不要用加样枪进行吹打，避免产生气泡。

11. 洗脱

  将孵育好的nc膜从孔槽中取出，放入装有TBST的平皿中，脱色摇床以固定转速清洗10分钟，三次。注意膜不要层叠在一起。

12. ECL显色

   将显色液从冰箱拿出，注意避光，将A液，B液按照等体积混合，一般一张膜用量1ml，用枪均匀滴在膜表面，剪开一个自封袋，用镊子把膜平整放在自封袋中，压好，避免产生气泡，放在光片夹中。

13. 曝光

  将装有nc膜的光片夹拿到暗室中，避免有任何的光源，在暗室灯中剪裁大小合适的胶片，层叠三张于nc膜上，压好，关上光片夹，计时20分钟，曝光后，在暗室将光片夹打开，放入显影液中静置3分钟后，放入定影液中清洗，此时曝光结束，出暗室，在清水下冲洗胶片。

14. 数据分析处理

  将曝光好的胶片进行分析，对比marker，观察目的蛋白条带是否出现，背景是否干净，条带差异是否真实符合逻辑，观察内参条带是否均一，在预实验中摸清抗体的准确稀释比，样本是否可用，根据预实验得出的结论，安排下一步的正式试验，试验情况良好，用扫描仪扫描胶片，根据内参条带，计算灰度值，确定样本组间灰度值的差异。