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技术宝典— Western Blotting
BioTNT Western Blotting 06 ------ 技术小技巧制胶这件小事

      说到Western Blotting,估计所有技术员都会联想到蓝底上的黑色条带,或者是仪器扫描的白底黑条图片。经过了漫长的实验流程,得到的会是清晰的、符合实验理论的完美结果,或者更多的是其他让自己略感失望的结局。

比起其他分子生物学实验,Western Blotting实验似乎更加冗长、更加考验技术,从实验准备,到最后曝光结果,任何一个步骤的丝毫疏忽,结果可能就差之千里。

在这里,BioTNT我先放下之后繁琐复杂的操作步骤,和大家聊聊Western Blotting实验基础中的基础——制胶。

不要小看制胶这件小事哦!Western实验是从电泳跑胶开始的(之前的样本处理算在实验准备里哈),因此电泳跑胶的质量直接影响到最终的实验结果,其中,聚丙烯酰胺凝胶的质量起到了决定性的作用。

 

要是在制胶时出现了瑕疵,会有怎样的结果呢?

好不容易配好的分离胶在凝固时居然只剩下了一半!没法用了,只能重制!那你一定是个新手,漏胶什么的最容易出现了。

曝光结束,发现条带不在同一水平线上,原本应在同一kDa值的条带却上上下下如同波浪线一般,好吧,那这块儿胶在配制的时候一定不匀。悲剧,从头开始吧!

还是在曝光结束,发现在垂直方向上有那么一小条出现了空白(或者说是黑色曝光细斑),不巧的,影响到了目的条带。嗯,那就是你在制胶的时候混了那么一点儿小气泡进去,蛋白们在跑胶时碰到气泡都绕道啦!

继续的,曝光结束,发现目的条带和非特异条带挤作一团,难舍难分,没法作为数据,这种情况比较复杂,可能原因是电泳时间不够,抗体质量不佳,样本中的蛋白过量,etc. 但是,你有没有想过,可能是你选错了胶的浓度?

还有诸如胶不凝、曝光条带大小不均、拔泳梳时坏胶、上样电泳时样本溢出等等问题,可能都与你制胶的小细节有问题哦!

 

怎么样,小瞧了制胶,吃大亏了吧!还是好好的、严肃的来看待制胶这个问题吧!

 

说到这个制胶,很多的少年们还不知道制的是什么胶吧(啊喂,前面说了,是聚丙烯酰胺凝胶啦!)?,在分子生物学实验中,常用的电泳胶有两种:琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶。这两个凝胶有什么区别呢?咳咳,本质区别啊!琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。其孔径相当大,现广泛应用于核酸的研究中。也就是说,琼脂糖凝胶,可以区分的是电荷量,以及大分子量的物质。

着重介绍一下我们的聚丙烯酰胺凝胶,他是聚丙烯酰胺聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。在电泳前,通过向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS(阴离子去垢剂),使蛋白质变性解聚,并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物,掩盖掉蛋白质之间原有电荷的差异,使各种蛋白质的电荷/质量比值都相同,因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。也就是说,聚丙烯酰胺凝胶,可以区分的是分子量相对较小的物质。

 

那么,聚丙烯酰胺凝胶里到底有些什么成分呢?

首先要说明的是,电泳时的聚丙烯酰胺凝胶其实是由两块(或者以上)不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶组合而成的,他们分别称为浓缩胶及分离胶,浓缩胶是4%聚丙烯酰胺凝胶,主要作用是将样本在上样时的高度差缩小,使得所有的蛋白能够处在同一起跑线上,进而得到更美观、更科学的数据。在部分实验室,并不用浓缩胶,这一做法不值得提倡哦!分离胶是真正的分子筛,通过聚丙烯酰胺形成的立体孔道,对不同分子量大小的蛋白进行分离。在一些实验室,分离胶选用的是梯度胶,即为使用不同浓度的胶依次叠加,所得到的胶分离效果更佳,不过,制胶的步骤多了,失败的可能性也大大增加哦!对于新手来说绝不推荐!

 

分离胶和浓缩胶中的成分基本相同,都是由以下这些组成:超纯水、聚丙烯酰胺、Tris盐酸、SDSAPTEMED。分别来说说它们的作用吧!

超纯水:…不说了

聚丙烯酰胺:由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂NN’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)按一定比例混合而成,分子筛作用,分离不同分子量大小的蛋白。顺便一提哦,丙烯酰胺是剧神经毒哦!操作时候可要特别当心啊!聚丙烯酰胺毒性相对较小,但是还是注意些吧!

Tris盐酸:缓冲液,保证胶的pH值正常。

SDS十二烷基硫酸钠,阴离子去垢剂,打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖各种蛋白分子间天然的电荷差。

AP过硫酸铵,催化剂,加速聚丙烯酰胺形成立体结构,即加速凝胶。

TEMEDNNN’,N’四甲基乙二胺,催化剂,加速聚丙烯酰胺形成立体结构,即加速凝胶。

 

在了解了这么多基本知识之后,我们终于可以制胶了吧!嘿,不!慢着!先想想,我们要制多少浓度的胶呢?不同的聚丙烯酰胺浓度所产生的分子筛作用不同,对之后的实验也会产生影响。常见的聚丙烯酰胺凝胶浓度有:8%10%12%(什么?梯度胶,咳咳,这里就不说了哈),视具体情况而定。

不同浓度的分离胶对相同范围分子量大小的蛋白有不同的分离作用,由此可得出对不同分子量蛋白所适用的相应浓度的分离胶。经过我们大量的实验数据得到,8%聚丙烯酰胺凝胶对35kDa以上蛋白的分离效果较好,对35kDa以下蛋白的分离效果较差;10%聚丙烯酰胺凝胶对15-170kDa蛋白的分离效果普通,对15kDa以下蛋白分离效果较差;12%聚丙烯酰胺凝胶对45kDa以下蛋白分离效果较好,对45kDa以上蛋白分离效果较差。

Western实验中,绝大部分蛋白的分子量在20-100kDa,因此在没有特殊要求的情况下使用10%的聚丙烯酰胺凝胶,可以基本保证不同分子量蛋白的分离以及对电泳蛋白的最高利用。

 

好了好了,我们还是制胶吧!

制胶这事儿其实真是个手艺活儿,需要一定的熟练程度。刚开始制胶,制出了一两块儿废胶,大家大可不必放在心上,想当年,BioTNT可足足制了一天,才制出能够进行实验的凝胶哟!

漏胶往往是每位技术员朋友最先遇到的问题,虽然制胶的制胶槽按照购买公司的不同也有所差别,但是总的来说大同小异,掌握手上的力度最为重要。对于制胶的新手,个人建议先别急着制胶,先把制胶器组装起来,往玻璃槽中加水,等过25分钟(即为胶凝固的时间),直到漏水现象基本解决后,就可以着手制胶了,一般来说,不漏水了,漏胶的可能就基本消除啦。在组装制胶器的过程中,要经常注意玻璃板底是否和制胶槽底是否平整,一旦不平整,漏胶的可能性就很大了哟。怎样才能平整呢?这就是力度问题啦,用力不能太轻,同样也不能过猛,太轻封不住,太猛就容易造成形变,这个度嘛,最后还是要自己找啊!BioTNT的同事也告诉我呀,有条件的实验室,可以在制作聚丙烯酰胺凝胶前,先往玻璃槽里加一些琼脂糖凝胶封个底,个人觉得也是不错的建议哟!

你以为不漏胶了,就算成功了?nonono!你还差得远呢!不要忘了,你刚刚到制胶这一步哦!

接下来,我就提几个需要注意的点,剩下的大家就自己加油吧!

首先,在制备液态胶的时候,需要格外小心,不要加错或者漏加什么东西哦,配制的母液也尽量是新鲜配制,不要使用已经保存很多时间的。配制好的液态胶需要充分的混匀,推荐的方式是上下温和颠倒。之前介绍过,AP以及TEMED是聚丙烯酰胺的助凝剂,要是一不小心没加,那你的胶可就凝不起来了哟(据说没有这两个东西凝胶要等个把星期哦,反正BioTNT是没等过)!

其次,在加胶时,注意尽量不要加入气泡。SDS是去垢剂,在混匀过程容易产生气泡,而在胶中混入气泡可是非常致命的哟!当在混匀时,手法要温和,混匀完后,将液态胶静置15秒左右再进行加胶,以使液态胶中的微小气泡上浮。另外,加胶时可以使用两档吸一档打的方式,防止在打完胶后打入空气,同时也应该注意枪头是否有气泡。

第三,压胶时滴加压胶液应均匀、缓慢。压胶是制胶时不可缺少的一步,平整的分离胶有助于得到平整的条带。常见的压胶液是异丙醇,也可以用超纯水替代。压胶不慎不仅不能压平分离胶,反而会使分离胶凹凸不平,甚至直接溶入分离胶,造成胶的不匀。在滴加压胶液时,应贴住玻璃板,由左至右缓慢滴加,控制每一滴压胶液的体积。

第四,应注意掌握凝胶的时间及温度。凝胶是一个化学反应,与温度、时间有一定关系。一般来说,当室温在10-25℃时,凝胶需要25分钟,室温较高时可酌情减少时间,相反的,室温较低时需适当增加。凝胶时间不足会造成胶不凝,而时间过长会使得拔泳道变得困难。

最后,在制作泳道时,要保持泳梳的垂直上下。在插泳梳时,将泳梳斜插会使得拔出困难,甚至造成坏胶(可能很大哟)。在拔泳梳时,斜拔会撬开玻璃板,这样上样可能会漏样哦!其次,泳道要保持一定的高度,即加入的液态分离胶一定要足量,否则上样时样本溢出可就是板上钉钉啦!对了对了,拔梳子的时候不要忘记加电泳缓冲液哦!

 

嗯?成功了?恭喜你啦!那么治好的胶可以长时间存放么?可以,但不是那么的长哦,强烈建议当日使用,要是必须延时存放,需加入足量(可以没过胶体)的电泳缓冲液,放入4℃冰箱,注意!DO NOT FREEZEN!要是在使用的时候发现你的电泳缓冲液结冰了,你可就中招了,重新融化后的胶在上样时非常容易漏样哦!也就是说,在大冬天时,不但不应该冷藏,反而应该保温!同时,建议的保存期不应超过1周,每天都应补充电泳缓冲液保持胶体湿润。

 

制完了胶,也就终于迈出了万里长征的第一步,接下来,才是正式的Western实验哦,不过,好的开始是成功的一半,有了一块好胶,成功的实验也就有了良好的基础,祝各位实验顺利,得到自己希望的结果吧!

 

相关试剂:

 

制胶(小量推荐)        
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 A20120A0300 50T 280  
制胶(超过50张膜--大量推荐)        
过硫酸胺Ammonium persulfate (APS)  A20120A0301 25G 150 A8090-25 
Tween 20  A20120A0302 100ml 30 国产 
甲叉双丙稀酰胺(Bic) A20120A0303 100g 150 M8200-100 
丙稀酰胺(Acr) A20120A0304 500g 40 国产 
TEMED 四甲基乙二胺  A20120A0305 10ml 42 T8090-100 
Tris•HCl  1.5mol/L(pH8.8) A20120A0203 100ml 60  
Tris•HCl  0.5mol/L(pH6.8) A20120A0204 100ml 60

 

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