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技术宝典— ELISA
BioTNT ELISA 12 ------ 初步探讨ELISA的分类和发展

引言

 

1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚苯乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体,建立了酶联免疫吸附测(Enzyme Linked Immunosrbent Assay,简称ELISA),后来人们改用板式反应孔进行ELISA,大大地提高了实验通量。ELISA实验具有极高的灵活性,实际操作中人们可以根据自己的需要以及手上已有的材料进行灵活的组合而进行各种可样的ELISA进行反应测定,另外ELISA实验中的相关试剂和耗材都已经商品化,所以ELISA被广泛地应用于生物学的各种研究中。通过ScienceDirect搜索可以看出,1975年只有1篇文献是研究ELISA的,1976年为6篇,但是到2010年这一数字上升到1994篇,历年文献累计达29490篇,足见其研究之广。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

 

 

ELISA的种类及原理

 

关于ELISA的分类众说纷纭,不同文献从原理或操作上都有不同的分类意见。这里先将ELISA分为以下四大类,然后针对每一类进行详细讲解:(1)直接ELISA;(2)间接ELISA;(3)夹心ELISA;(4)竞争抑制ELISA。其它的ELISA都隶属于这四类ELISA或由这四类ELISA组合衍生。

 

 

【直接ELISA

 

直接ELISA是所有ELISA中步骤最简单的一种,其方法是将抗原按一定的

比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上,包被完成后简单洗涤,再加入封闭液,封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液,加入稀释好的特异性的酶标抗体,37℃温育一小时或4℃温育过夜后,洗涤除去多余的抗体,加入底物显色并判读结果。最后显色的深浅与加入的酶标抗体量成正比。直接ELISA的原理如图1

 

1直接ELISA原理

 

一个很常见的直接ELISA实例就是检测单抗亚型,实际操作中可以将经过亲和纯化的单抗包被在酶标板上,封闭后加入酶标分型二抗,最后加底物显色即可。此外用直接ELISA可以检测血清种属,也有人用直接ELISA进行单克隆抗体制备中的初步筛选。不过虽然直接ELISA操作很简单,步骤也比较简练,但是其应用范围还是非常有限的,一个重要的原因是这种ELISA中只经过了一步信号放大(酶的放大),所以其灵敏度不是很高,另外其测定的对象也非常有限,只能测定酶标记的分子。

 

 

【间接ELISA

 

间接ELISA的步骤与直接ELISA步骤前面的部分基本一致,不同的是,间接ELISA中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体,而是非酶标的,另外再引入第二种抗体(即二抗),二抗是经过酶标的,它可以与第一种抗体(与抗原直接结合的抗体,即一抗)特异性结合。最后加入底物显色并判读结果。当二抗的浓度一定的时候,最终的显色结果与一抗的量是正相关的。间接ELISA的操作如图2,同直接ELISA将抗原包被到酶标板上,洗涤后封闭,再次洗涤后加入稀释好的待检抗体(一抗),温育后洗掉未与抗原结合的一抗,再加入酶标二抗,再次温育,此时酶标二抗即可与一抗结合,最后加入底物显色。

 

由于二抗一般为多抗,因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子,同时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子,所以当待测抗体为多抗时(可以由多个一抗分子与抗原结合),信号经过两步放大,最终提高了检测的灵敏度。另外由于二抗制备比较容易,而且很早就开始商品化,所以操作者无需要将一抗进行酶标,大大缩减了工作量。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选过程中,间接ELISA都是非常重要的实验过程,在临床诊断中,间接ELISA也是检测标志性抗体的重要手段。

 

2间接ELISA原理

 

 

【夹心ELISA

 

夹心ELISASandwich ELISA)总体上可以分为两种:直接夹心ELISA和间接夹心ELISA。直接夹心ELISA又分为双抗夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。双抗夹心ELISA的方法是:将第一种抗体(捕获抗体)包被在固相载体上,封闭后加入待检抗原,温育后加入第二种抗体(检测抗体),捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗,也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗,但是检测抗体需要经过酶标。双抗原夹心ELISA的原理和操作与双抗夹心基本相同,不同的是包被的是抗原,待检对象是抗体,然后加入酶标抗原,再加底物显色。直接夹心ELISA的原理如图3

 

3直接夹心ELISA原理

 

对于双抗夹心ELISA,待检对象必须包括两个或者两个以上的表位,否则检测抗体无法与待检抗原结合,例如半抗原和小分子抗原都是不能用双抗夹心ELISA检测的。对于双抗原夹心ELISA,其操作与间接ELISA基本相同,但利用特异性的抗原代替酶标二抗,所以特异性比间接法更好。另外,由于间接ELISA中使用的二抗一般只能识别IgG,而双抗原夹心ELISA中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出,因此双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。

 

下面我将结合一些试剂盒举例说明加拿大(yesbiotechAnogen) human interleukin-8(IL-8),这个指标试剂盒的用到的系统就是这种直接夹心ELISA,在此基础上发展了亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system),以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原),加拿大(yesbiotechAnogen) human interleukin-1β(IL-1β)TNF-α,IL-6 均用到此体系。

 

间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA,其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上(作为捕获抗体),封闭,加入待检抗原,温育,洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体(非酶标,作为检测抗体),最后加入酶标二抗(特异性识别检测抗体),再加底物显色。间接夹心ELISA的原理如图4。与直接双抗夹心ELISA相比,间接夹心ELISA中引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗,相当于整个体系的信号增加了一步放大系统,于是最终的结果比直接双抗夹心ELISA更灵敏。同时,由于间接夹心ELISA中的酶标二抗仅能识别检测抗体,而不能识别捕获抗体,所以体系的特异性也得到了保障。值得提出的是,间接夹心ELISA并不是严格要求捕获抗体与检测抗体来源于同一物种,也可以是这种情形:仅用特异性的抗体的Fab片段包被固相载体作为捕获抗体,而用未经处理的同种属来源的特异性抗体作为检测抗体,酶标二抗选用只针对检测抗体的Fc段的二抗,这样的酶标二抗同样不能识别捕获抗体,从而使这种体系里的捕获抗体与检测抗体起到类似于不同种属来源的效果。间接夹心ELISA涉及的体系比较复杂,用到的试剂也比其它的ELISA复杂,但是其检测灵敏度上的优越性使它在检测那些低丰度抗原的样品中应用得十分广泛。

 

4间接夹心ELISA

 

 

【竞争抑制ELISA

 

竞争抑制ELISA又叫封闭ELISA,其主要原理是用待检抗原或抗体去干扰已经预先设计好的体系,最终显色的结果与待检抗原或抗体的干扰程度成负相关。竞争抑制ELISA灵活性很强,可以在此基础上设计出更复杂的实验方案,从而派生出所谓的直接竞争抑制ELISA、间接竞争抑制ELISA、夹心竞争ELISA等特殊的ELISA方法。这里仅以直接竞争抑制ELISA和间接竞争抑制ELISA为例简单阐述原理。直接竞争抑制ELISA中,预先将抗原包被在固相载体上,并加入酶标的特异性抗体。实验时,加入待检抗原(或抗体),如果待检对象是抗原,则待检抗原就与预先包被在固相载体上的抗原竞争结构酶标抗体;如果待检测对象是抗体,则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。洗涤过程就可以洗掉被竞争下的酶标抗体,最后加底物显色。最终显色的结果与待检原(或抗体)量成反比。直接竞争抑制ELISA的原理如图5。注意在直接竞争抑制ELISA中,同一预制备的体系既可以测定抗原,也可以测定抗体。

 

5直接竞争抑制ELISA原理

 

如同间接ELISA一样,直接竞争抑制ELISA也有两步信号放大的过程,因此其灵敏度也比较高,但是预先包被好固相载体并加入酶标抗体后,实验时只需要将待检抗原或抗体稀释后加到体系中进行反应即可,大大简化ELISA的操作过程。用到此系统的试剂盒如德国(LDN) cortisolDHEA-S,Estradiol等这些指标。

 

间接竞争抑制ELISA可以看作是用待检抗原或待检抗体干扰一个预先制备的间接ELISA系统。其具体原理是:将抗原包被于固相载体上,依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗作为预制备的体系。实验时,加入稀释好的待检抗原(或抗体),待检标本中的抗原(或抗体)就和预制备体系中固相载体上结合的抗原(或抗体)竞争结合特异性的抗体(或固相载体上结合的抗原)。同间接ELISA一样,间接竞争抑制ELISA也有三步信号放大以其灵敏度也比直接竞争抑制ELISA高。试剂盒(PHOENIXACTH,CRF指标中会用到此系统。

 

 

从上述原理可以看出,竞争抑制ELISA对试剂的要求非常少,不管是单抗还是多抗都可以用于实验,更重要的是不管被检对象是大分子物质还是多肽、小分子药物、小分子激素等只有一个表位的分子不能使用夹心ELISA的都可以使用竞争抑制ELISA检测。另外,像乙肝标志物检测中,e抗原很不稳定,容易降解变为核心抗原,因此在检测e抗体时不能用夹心ELISA检测而只能选用竞争抑制ELISA

 

除以上介绍的几种基本的ELISA外,人们还可以根据自己的实际需要灵活设计其它类型的ELISA,例如引入非酶标二抗或者ProteinAProteinG等增加固相载体的载量或者增加系统的特异性等。

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