一、   ELISA试剂的准备

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用（非常重要，特别是酶标板要平衡到室温才能把铝箔袋的口打开）。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

二、   加样

在ELISA中一般有3到四次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加 标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA） 需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶 结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

三、   ELISA实验操作中的温育(incubation)

在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation) 。

温育的温度：根据酶的活力，一般是室温温育或者37度温育；

保温的方式：室温温育可以在有空调的房间里（20-25度）；或者在控温的培养箱里；温度不能过低或者过高；37度温育可以在水浴箱里，或者在培养箱（恒温箱），如果在恒温箱里温育，好放在湿合里进行温育；

注意：为了防止在温育过程中水分的蒸发，请温育时贴上膜（如果试剂盒中没有，可以用保鲜膜替代）；

温育时注意温度的控制，仪器在之前用温度计校正过温度；空调房间应选择比较恒温的地方；

四、   洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过 洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性 的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按 要求洗涤，不得马虎。

洗涤的方式有自动洗涤和手工操作两种，手工操作过程如下：

a.       吸干或甩干孔内反应液；

b.       用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；

c.        浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；

d.       吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；

e.       重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。

手工洗板的注意事项：

1、  加洗涤液第一遍的加液顺序尽量和第二遍的加液顺序相反，以保证每个孔的浸泡时间基本相同；

2、  前面拍板可以比较轻松不用太大的力气，后一遍拍板一定要拍干，拍好后对着光线看有无残液。

3、  小窍门一：有时候板条在板上比较松，请对板条进行标记，以免板条脱落，找不到对应的板孔；也可以用胶带固定板条，以免脱落；

4、  小窍门二：用毛巾包着板条进行拍板，能用得上力气，节省纸张，也能拍得更干净。

5、  在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

6、  洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率好在1.5us/cm 之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。

7、  保证洗板浸泡时间为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。

五、   显色和比色

显色是ELISA中的后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是 影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应 温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时 间，及时判断。

TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。

加入各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。

比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。

比 色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OD的吸收波长为492nm，表示方法为“A492nm”或“OD492nm”。

六、   酶标仪

酶标仪，又称酶标比色仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、 线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标 仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范 围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围

酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。

测读OD值时，要选用产物的敏感吸收峰，如TMB用450nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OD用492nm为W1，630nm为W2，终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双 波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

各种酶标仪性能有所不同，使用时请详细阅读说明书。

七、   ELISA实验的结果判断

ELISA 实验的定性判断——常用于临床检测项目：

定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统 中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系 列稀释后进行试验，呈阳性反应的高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具 定量意义。

在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。

间接法和夹心法

应该用酶标仪（酶标比色仪）测定吸光值，这样可以得到客观的数据。

竞争法

在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应为敏感。

竞争法ELISA因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，必须用酶标仪读数，进行计算。

八、   ELISA实验的定量测定

ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为 纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是理想的检测区域。

测定大分子量物质的夹心法ELISA，某些试剂是直线回归；

某些试剂是二次曲线回归；

某些试剂是双对数直线回归；

这三个都是差不多的；

如果对酶标仪的软件计算比较熟悉，也可以用酶标仪设定软件来进行计算。由于不同的试剂盒对应的软件计算公式可能不同，而且一旦操作存在误差的话，人工分析可以对偏差点进行舍弃处理，所以一般不推荐仅采用酶标仪一种方式的数据计算。

部分仪器自带分析软件，可以进行定量拟合处理并输出定量值。

双抗夹心法，建议用酶标仪对空气读数，然后酶标仪再对标准品0孔读数，再进行定量计算（选择合适的拟和方式）。得到三套数据，以便进行数据分析。

推荐：采用elisacalc 软件进行分析计算。