引物从文献中得到后，或者由公司提供得到后，比较稳妥的方式是在ncbi网站上对上游和下游引物分别进行Blast分析，以确定该对引物是否特异扩增靶基因，而且不会扩增非靶基因。

具体方法是：

进入ncbi的blast 网站：

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

选择nucletide blast，点击进入：

也可直接点击：

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome

在框里复制上游引物，和下游引物；中间用分行符隔开；

如果你比对的是mRNA序列， 选择 reference RNA sequence（refseq-rna）；

如果是其他序列，分别选择；如果不确定是什么，选择nucletide collection（这是大的一个库）；

点击下方的blast按钮；

会跳出如下界面：

判断原则：

一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

1、maxscore， 是和输入的引物长度有关的；一般40bp长度，完全匹配时大约在40左右；

2、完全匹配时，total score大约在80左右，如果totalscore 特别高，则说明该引物可能在这个序列上有多处匹配，重复性高，并不是好的引物；

3、设计的目的基因，query coverage 必须是100%；针对同种属的其他的基因，如果也列出来，则query coverage 越低越好；