原理篇：
Y1：什么是PCR？
答：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
Y2：PCR可以用来干嘛？
答：能将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
Y3：REAL TIME PCR和普通PCR有什么区别？
答：在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。
Y4：REAL TIME PCR 的优势在哪里？
答：实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR污染问题，自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
Y5：REAL TIME PCR的原理是什么？
答：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
Y6：REAL TIME PCR为什么能够定量检测？
答：在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
Y7：如何确定REAL TIME PCR产物的特异性？
答：不同的PCR产物有不同的Tm值，设计引物时可以得到产物序列并可以计算出相应产物的Tm值，由软件得到的Tm值与设计的Tm值间相差不超过2℃，视为特异性产物。
Y8：要做QPCR需要什么特殊的试剂和仪器吗？
答：可以采用染料法或者探针法，各自需要不同的试剂；仪器需要：real time PCR 检测仪。
Y9：做REAL TIME PCR 有几种系统可以选择？
答：经典的有两种方法：染料法或者探针法。
Y10：怎样选择REAL TIME PCR系统？
答：请参考《Real time PCR mRNA 定量实验路线选择F&Q》（http://www.BioTNT.com/news/news_109.htm）
Y11：Real time PCR mRNA相对定量中内参如何选择？
答：一般选择beta-actin， GAPDH ，18sRNA 等相对丰度比较均一的基因作为内参基因；也可以根据参考文献选择内参基因；
注：BioTNT 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs）（http://www.BioTNT.com/product/product_32250.html）
严格的选择内参基因的方式应该有如下步骤：
① 针对您要检测的实验组选择部分有代表性样本；
② 统一抽提RNA；
③ 测定RNA