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技术宝典— qPCR
BioTNT qPCR 02 ------ 样本制备及注意事项

一、PCR 实验中细胞的采集、处理和保存

 

1、细胞板贴壁细胞直接裂解:

细胞弃培养上清,加入适量裂解液(如:1mlTrizol)重悬细胞(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打200下;

2、细胞团块裂解:细胞团块加1ml PBS重悬(注意不要过于剧烈造成细胞破裂),1000rpm离心5分钟,弃上清,重复3次,加适量Trizol重悬(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打200下;

3、悬浮细胞裂解:转移至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,加适量Trizol重悬(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打200下;

4.保存

上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

 

 

二、PCR 实验中易碎组织(脑、肝、肾)的采集、处理和保存

 

1、样品按50-100mg,加入1mlTrizol,另外组织体积不能超过Trizol体积的10%。否则匀浆效果不好,且组织块太多,会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA发生降解

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;

3、冰水浴中电动匀浆机(每个样本20-30s)或超声破碎;

4、保存

上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

 

 

三、PCR实验中不易碎组织如(心肌、肌肉组织)的采集、处理和保存

 

1、样品按50-100mg,加入1mlTrizol,放入冰箱,静置3小时

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;

4、保存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

备注:心肌、肌肉组织无法用匀浆机匀浆,组织块会绞入钻头形成团块,无法被匀浆机刀头切碎,需用研磨或超声才能充分破碎。

 

 

四、PCR实验中上皮组织(皮肤、膀胱、肠)的采集、处理和保存

 

1、样品按50-100mg,加入1mlTrizol,放入冰箱,静置3小时

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;

4、保存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月

备注:上皮组织韧性较强,较难剪碎,需要增加组织破碎时间才能充分破碎。

 

 

五、PCR实验中小颗粒组织(如:神经节、小鼠眼角膜、巩膜、韧带)的采集、处理和保存

 

1、加入1mlTrizol

2、冰水浴中用显微剪剪碎组织块;

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;

4、保存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月

 

备注:小颗粒组织量比较小,会有RNA量低于检测限度的风险,且样本量太少,无法被匀浆机刀头切碎,需用研磨或超声才能充分破碎。研磨时应格外细心。

 

 

六、PCR实验中骨头组织的采集、处理和保存

 

1、用已消毒过的咬骨钳将骨组织咬碎

2、加入1mlTrizol,放入冰箱,浸泡半天,使骨头软化

3、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块

4、冰水浴中电动匀浆机(每个样本20-30s)或超声破碎;

5、保存

上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月。

 

 

七、PCR实验中全血的采集、处理和保存

 

1、采集血样,室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。

一般使用EDTA或肝素抗凝均可;血量一般为1ml

2、从全血中提取淋巴细胞后,加入1mlTrizol裂解淋巴细胞(全血提取淋巴细胞见附录)

3、超声破碎或用枪吹打200

4、保存

将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

备注:全血千万不能放入干冰中送样,应室温保存

 

 

附录I:qPCR样本制备的注意事项

 

足量的并且保证纯度的细胞或组织

 

1、取动物的组织,动作要求迅速,尽量避免样本在环境中暴露太久;

2、将组织或细胞迅速放入无菌无酶的冻存管中,为保证质量,推荐选取Axygencorningnunc等国外品牌的冻存管;

3、在冻存管上做好标记,尽量清晰易辨;在实验记录本上做好记录,尽量详细易查;

4、将冻存管直接放入液氮中速冻;或加入1ml Trizol 到冻存管中,再放入液氮速冻;

5、速冻2h 后,将冻存管从液氮转至-80度冰箱,可以保存6个月左右;

6、尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA,因为即使冻存,降解仍然存在。

样本运输:液氮或干冰运输

7、全血千万不能放入干冰中送样,应室温保存,且采集完全血后,应尽快处理,从其中分离出所需的淋巴细胞

 

 

附录II:经典Trizol法制备RNA注意事项

 

1、  RNA很容易降解,实验时一般都要求实验人员的穿戴齐备外,还需要注意环境是否有大量空气流通和污染。

2、  关于TrizolTrizol中主要作用的成分是异硫氰酸胍及RNA酶抑制剂,能很好保护RNA不被降解,并且使RNA更易从组织或细胞中释放出来,但要注意的是,1mlTrizol多只能裂解100mg的组织,Trizol无法完全浸润组织无法完全裂解组织,过多组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。

3、  氯仿萃取后离心分层取上清这一步中,没有必要吸干上层水相,因为误吸入水相和有机相中间夹层中的基因组DNA导致污染远比损耗1-2倍的RNA结果要严重的多。

4、  RNA的沉淀有无并不决定RNA制备的成功与否,肉眼不可见的RNA也能跑出非常漂亮的PCR条带或曲线。

5、  记住,Trizol法提取的RNA为总RNAmRNAmicroRNA在其中占比并不大,大部分是rRNA,所以用测RNA浓度或电泳法检验RNA的质量是无法直观反映mRNAmicroRNA的质量,建议直接PCR跑个内参试试。

 

 

qPCR样本提取相关产品

 

品名

货号

规格

价格

RNA提取试剂盒(Trizol )

A2010B0A01

100ml

1980

RNA提取试剂盒(Trizol )

A2010B0A02

200ml

3540

mRNA CDNA第一链合成试剂盒

A2010B0B01

60T

980

mRNA CDNA第一链合成试剂盒

A2010B0B02

120T

1875

PCR array cDNA第一链合成试剂盒

A2010B0B03

12T

1600

miRNA cDNA第一链合成试剂盒

A2010B0B04

120T

1750

人外周血淋巴细胞分离液

P8610

200ml

170

小鼠外周血淋巴细胞分离液

P8620

200ml

560

大鼠外周血淋巴细胞分离液

P8630

200ml

560

 

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