一、PCR 实验中细胞的采集、处理和保存

1、细胞板贴壁细胞直接裂解：

细胞弃培养上清，加入适量裂解液（如：1ml的Trizol）重悬细胞（过量会降低浓度，很重要），超声破碎或用枪吹打200下；

2、细胞团块裂解：细胞团块加1ml PBS重悬（注意不要过于剧烈造成细胞破裂），1000rpm离心5分钟，弃上清，重复3次，加适量Trizol重悬（过量会降低浓度，很重要），超声破碎或用枪吹打200下；

3、悬浮细胞裂解：转移至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，加适量Trizol重悬（过量会降低浓度，很重要），超声破碎或用枪吹打200下；

4.保存

上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（不应反复冻融，否则会使RNA降解）

-20℃下，可放置保存1个月；

-80℃下，可放置保存6个月；

二、PCR 实验中易碎组织（脑、肝、肾）的采集、处理和保存

1、样品按50-100mg，加入1mlTrizol,另外组织体积不能超过Trizol体积的10%。否则匀浆效果不好,且组织块太多，会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA发生降解

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中电动匀浆机（每个样本20-30s）或超声破碎；

4、保存

上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（不应反复冻融，否则会使RNA降解）

-20℃下，可放置保存1个月；

-80℃下，可放置保存6个月；

三、PCR实验中不易碎组织如（心肌、肌肉组织）的采集、处理和保存

1、样品按50-100mg，加入1mlTrizol，放入冰箱，静置3小时

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（不应反复冻融，否则会使RNA降解）

-20℃下，可放置保存1个月；

-80℃下，可放置保存6个月；

备注：心肌、肌肉组织无法用匀浆机匀浆，组织块会绞入钻头形成团块，无法被匀浆机刀头切碎，需用研磨或超声才能充分破碎。

四、PCR实验中上皮组织（皮肤、膀胱、肠）的采集、处理和保存

1、样品按50-100mg，加入1mlTrizol，放入冰箱，静置3小时

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（不应反复冻融，否则会使RNA降解）

-20℃下，可放置保存1个月；

-80℃下，可放置保存6个月

备注：上皮组织韧性较强，较难剪碎，需要增加组织破碎时间才能充分破碎。

五、PCR实验中小颗粒组织（如：神经节、小鼠眼角膜、巩膜、韧带）的采集、处理和保存

1、加入1mlTrizol

2、冰水浴中用显微剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（不应反复冻融，否则会使RNA降解）

-20℃下，可放置保存1个月；

-80℃下，可放置保存6个月

备注：小颗粒组织量比较小，会有RNA量低于检测限度的风险，且样本量太少，无法被匀浆机刀头切碎，需用研磨或超声才能充分破碎。研磨时应格外细心。

六、PCR实验中骨头组织的采集、处理和保存

1、用已消毒过的咬骨钳将骨组织咬碎

2、加入1mlTrizol，放入冰箱，浸泡半天，使骨头软化

3、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块

4、冰水浴中电动匀浆机（每个样本20-30s）或超声破碎；

5、保存

上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（不应反复冻融，否则会使RNA降解）

-20℃下，可放置保存1个月；

-80℃下，可放置保存6个月。

七、PCR实验中全血的采集、处理和保存

1、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。

一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml

2、从全血中提取淋巴细胞后，加入1ml的Trizol裂解淋巴细胞（全血提取淋巴细胞见附录）

3、超声破碎或用枪吹打200下

4、保存

将细胞放入冰箱冻存（不应反复冻融，否则会使RNA降解）

-20℃下，可放置保存1个月；

-80℃下，可放置保存6个月；

备注：全血千万不能放入干冰中送样，应室温保存

附录I：qPCR样本制备的注意事项

足量的并且保证纯度的细胞或组织

1、取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；

2、将组织或细胞迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等国外品牌的冻存管；

3、在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；

4、将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；

5、速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；

6、尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA，因为即使冻存，降解仍然存在。

样本运输：液氮或干冰运输

7、全血千万不能放入干冰中送样，应室温保存，且采集完全血后，应尽快处理，从其中分离出所需的淋巴细胞

附录II：经典Trizol法制备RNA注意事项

1、  RNA很容易降解，实验时一般都要求实验人员的穿戴齐备外，还需要注意环境是否有大量空气流通和污染。

2、  关于Trizol，Trizol中主要作用的成分是异硫氰酸胍及RNA酶抑制剂，能很好保护RNA不被降解，并且使RNA更易从组织或细胞中释放出来，但要注意的是，1ml的Trizol多只能裂解100mg的组织，Trizol无法完全浸润组织无法完全裂解组织，过多组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。

3、  氯仿萃取后离心分层取上清这一步中，没有必要吸干上层水相，因为误吸入水相和有机相中间夹层中的基因组DNA导致污染远比损耗1-2倍的RNA结果要严重的多。

4、  RNA的沉淀有无并不决定RNA制备的成功与否，肉眼不可见的RNA也能跑出非常漂亮的PCR条带或曲线。

5、  记住，Trizol法提取的RNA为总RNA，mRNA和microRNA在其中占比并不大，大部分是rRNA，所以用测RNA浓度或电泳法检验RNA的质量是无法直观反映mRNA和microRNA的质量，建议直接PCR跑个内参试试。

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