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技术宝典— qPCR
qPCR 引物篇 04 ------ BioTNT 引物筛选/primer 浓度的说明

BioTNT 关于引物浓度的使用说明

 
引物primers  分为以下三种:
 
1、合成的干粉引物:
 
合成的干粉引物,浓度一般为2OD; 是以O.D.260单位来计量的。
1 O.D.260值系指在1ml体积1cm光程标准比色皿中,于260nm波长下的吸光度为1A260。 1 O.D.260 值相当于33ug的oligo (国际统一标准),而每个碱基的平均分子量一般以330道尔顿进行计算。客户可根据此数据和oligo的分子量得到摩尔数以计算溶液浓度。
分子量计算公式如下:
MW=(A碱基数×312) + (C碱基数×288) + (G碱基数×328) + (T碱基数×303)-61
摩尔数的计算公式如下:
nmol数 =   O.D.值×33(ug)÷1000MW
 例: 序列GTTGAGTGCTGGGCGTAG, OD260值为2, 加1000ul消毒双蒸水溶解:
 A= 2      C= 2     G= 9     T= 5
        MW = (2×312) + (2×288) + (9×328) + (5×303) -61=5606
         质量数 = 2×33ug= 66ug
       nmol数 = 66×1000÷5606=11.77 nmol
 
● Oligo 呈干粉状黏附在试管壁上,打开时极易散失,所以开试管前应先离心,然后小心打开管盖.配液时请加入适量双蒸水溶解,充分振荡5-10分钟。 
● 本核苷酸的5’和 3端均为羟基,若需加连磷酸基团,则需另外处理。
● 如对oligo进电泳分析,请用含7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳和1倍TBE缓冲液,不可使用琼酯糖电泳。为了防止加样时的扩散和二级结构影响,上样前需用饱和尿素处理。    ● -20以下长期保存。 
 
举例:引物合成单上标注10nmol;可以用100ul的水复溶,得到100umol/l浓度的储存液;
 
2、部分实验室使用的引物工作液浓度:
 
部分实验室习惯将引物工作浓度定为10umol/l; 即在干粉引物复溶后的储存浓度100umol/l的基础上稀释10倍,得到10umol/l的工作浓度;
进行PCR 反应时,通常在10ul 体系中加入0.2ul上游引物,0.2ul的下游引物,得到200nmol/l的终浓度;或者在10ul 体系中加入0.4ul 上游引物,0.4ul的下游引物,得到400nmol/l的终浓度;
优点:引物工作浓度较高,可以作为储存浓度;
缺点:使用时加样体积过小,容易产生较大的加样系统误差;
 
3、BioTNT 引物筛选提供的引物浓度:
 
BioTNT 为了方便客户使用,提供的引物浓度为2umol/l, 在终反应体系里是10*的浓度,即20ul 体系中,上游引物加入2ul,下游引物加入2ul。
 
 
其他内容请参考:
 
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