版本号：20100001
BioTNT qPCR Primer Assay for specific mRNA genes
目录号：SER-PCR –编号（500T）;
说明书 Part A
一、产品简介：
本试剂盒是基于可靠的SYBR® Green-based定量real-time PCR试剂盒并应用基因表达分析。
我们的实验为基因特异性定量PCR验证具有统一、高效和标准化特点的扩增反应条件。
每一对引物都是经过严格的实验验证的。
已经使用适当的real time PCR Mix的时候，合适的片段大小和高的扩增效率成为保证。
qRT-PCR Primer pair kits统一的扩增效率和条件为荧光定量pcr实验中多基因表达的检测提供了准确而灵活的解决方案。
完整的试剂盒说明书由part A 和Part B构成。Part A 主要描述了本试剂盒的使用方法和注意事项，Part B主要注明了assay 的特异情况。
二、产品特点：
本产品适用于有一定q PCR实验经验的客户或者无经验的客户在公司的技术指导下进行。
三、保存条件：
可在常温下运输。常期保存请在-20℃保存，效期12个月。
警告：本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等其他用途。
安全提示：本产品中部分试剂有腐蚀性或毒性，请勿直接接触皮肤或吞咽；操作时请穿戴实验服、防护镜和手套；如果接触皮肤，应立即用洗涤剂和大量清水冲洗；误食或其他危急情况，请及时到医院就治；部分试剂易燃，请注意消防安全。
四、注意事项：
请在收到此试剂盒后立刻检查试剂盒组成，BioTNT 公司只负责受理在试剂盒签收后三个工作日内的试剂缺失报告；
五、试剂盒组成：
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试 剂
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说 明
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T
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qPCR上游引物
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10×
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1ml （500T）
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qPCR下游引物
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10×
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1ml （500T）
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其他特点请参照Part B。
六、保证结果可使用的qPCR试剂：
BioTNT real time PCR Premix 货号：A2010A0112
七、其他需要自己准备的：
1、 耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（无菌、无酶、RNase-free；货号Axygen-MCT-150-C），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的枪头；）；
2、 检测的样本CDNA；
3、 无菌无酶的 PCR 水（货号：A2010B0X03）；
4、 离心机；移液器（10μL ，200μL，1000μL）；
5、 手套，口罩。
八、预防RNase污染，应注意以下几个方面：
1、 经常更换新手套，以防止RNase污染；
2、 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染；
3、 RNA在Rrizol试剂中时短时间内不会被RNase降解，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料或玻璃器皿（玻璃器皿可在150℃烧烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase）；
4、 配制溶液应使用RNase-free ddH2O（货号：A2010B0X03）
九、操作步骤：
1、 请混匀所有的试剂（15秒）；
2、 请按以下配比对每个反应配20μL的体系：
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反应液组份
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用于荧光PCR实验
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加量 (μL)
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终浓度
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备注
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Real time PCR Premix试剂混合物
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10
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1×
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货号：
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上游引物（10×）
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2
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1×
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下游引物（10×）
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2
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1×
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待检DNA样品
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1
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用户提供*
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PCR水
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5
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总体积
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20
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l 注意：如果您的cDNA模板不是使用BioTNT的cDNA第一链合成试剂盒（货号：A2010B0B01，A2010B0B02）进行逆转录合成的，请适当的调整cDNA的用量（1-6μL），调整无菌去离子水的用量，使总体积保持20μL；
l 注意：如果您不使用BioTNT real time PCR Premix，请做引物浓度梯度实验，以使实验达到佳效果；
l 注意：建议MIX引物、标本与PCR水预混，在实验操作中尽量避免使用移液器的小量程，尽量减少加样次数，以减少因加样而导致的误差。在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、移液器头(带滤嘴自卸式)，不能用手直接触摸PCR反应管/条/板。
l 注意：如果使用其他体积的体系（5-50μl），应保证终浓度与说明书上的终浓度一致。配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，避免产生气泡。如果产生气泡，请用手指将气泡弹破，再低速离心。反应体系配制完毕后低速离心数秒，立即进行PCR扩增。
l 大多数仪器建议采用20ul体系；Roche的lightcycler 和ABI 7900，stepone plus， viia7 等可以采用10ul体系；
l 建议每个样本同一个基因做双重复或者三重复；
l 设立阴性对照(即加样品的时候用水来代替);
l 建议购买BioTNT 的阳性对照( 货号: A2010B0X10 ); 并在实验中设立阳性对照;
1、 低速离心数秒，并且按照荧光PCR仪的使用说明放置好您的PCR管/条/板；
2、 从下列表中选择合适的实验反应条件，按照荧光PCR仪的使用说明设置好PCR反应条件：
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荧光PCR仪
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循 环
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时 间
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温 度
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ABI: 5700, 7000, 7300, 7500, 7700, 7900HT, StepOnePlus
BioRad: iCycler®, iQ5, MyIQ
Stratagene: Mx3000p, Mx3005p, Mx4000p
Eppendorf: Mastercycler® ep realplex
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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40
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15 seconds
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95℃
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1 minute [2]
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60℃
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Roche*: LightCycler 480®
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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45
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15 seconds
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95℃
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1 minute [2]
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60℃
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*
注意罗氏LightCycler 480 ®用户：请调整升温速率为1℃/秒。更多关于其他所需的改变和熔融曲线设置的信息请参阅仪器安装指南。
3、 下列仪器使用三个步骤的循环程序：
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荧光PCR仪
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循 环
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时 间
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温 度
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BioRad: CFX96, CFX384, Opticon,
Opticon 2, Chromo 4 (MJ Research)
Takara: TP-800
All other instruments
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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40
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15 seconds
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95℃
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20 到30 seconds
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60℃
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30 seconds [2、3]
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72℃
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[1] 95℃ 5分钟的步骤是为了激活热启动DNA聚合酶。
[2] 检测并记录荧光染料荧光信号在每个周期的延伸结束时。
[3] 不同的仪器需要检测荧光信号的时间长短不同，请根据您的仪器选择适当的延伸时间。
反应条件示例：95℃ 5分钟→95℃ 15秒→60℃ 30秒（读板）→溶解曲线分析；
40个循环
注：以上反应条件是应用BioTNT 染料法premix（货号：A2010A0112），在ABI stepone plus上的反应条件。请注意，第一步95℃ 5分钟 是BioTNT premix的hot start的特点，如使用其他公司的premix，请调整这一步的反应时间。
十、实验结果判断:
i.阳性对照(或者客户的阳性模板)的内参基因的熔解曲线呈单峰，其Tm与引物说明书上的产物Tm相近；扩增曲线呈S型； 双重复重复良好（Ct值相差不超过1），说明加样误差和仪器误差比较小，可用；如果 CT相差超过1.5，该数据不可用，需要重新检测；
ii.阴性孔Ct＞33，熔解曲线在目的产物或内参产物峰处无明显特异性产物峰出现，说明实验体系无污染，数据可信；
iii.内参实验的CT值在15-25之间，可根据文献来确定内参基因CT应该在的区域，来进行数据判断，抽提和逆转录的可靠性；
iv.其他情况请参考实验疑难分析与解答或咨询公司技术人员。
十一：内参基因的选择：
1、 对照组和实验组的内参基因，尽量少受实验干预的影响；可以进行多个内参基因的比较，选择较少受实验干预影响的内参基因；
2、 请选择与目的基因CT比较接近的内参基因，来作为实验的内参基因，进行均一化处理。
十二、Trouble shooting
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问题
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解决
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样本没有扩增曲线
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查看仪器设置，是否设置正确的荧光读板时间，不同机器有不同的读板方式；即使没有扩增，也会有荧光检测曲线；ABI 机器在部分错误设置时，不能显示正确的扩增曲线；ABI机器可以查看仪器的原始荧光信号；
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样本没有熔解曲线
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查看熔解曲线设置是否正确；
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杂乱的熔解曲线
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可能没有产物；查看BioTNT microRNA assay提供的阳性CDNA 对照进行real time PCR 扩增结果如何；
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熔解曲线峰与BioTNT microRNA assay 中提供的tm 值不一致
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与公司的技术部联系
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阴性对照有扩增曲线，且熔解曲线峰与目的产物峰相同
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被污染，注意加样和PCR的防污染措施
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相关的产品：
1、 Trizol法总RNA提取试剂盒，货号： A2010B0A01（20T）， A2010B0A02（50T），A2010B0A03（100T） ；
2、 cDNA第一链合成试剂盒，货号：A2010B0B01（50T），A2010B0B02（100T）；
3、 real time PCR Premix试剂盒，货号： A2010A0112；
4、 目的基因阳性对照，货号：A2010B0X10；
5、 内参基因real time PCR primer pairs，货号：A2010AH001 （500T）; A2010AM001 （500T）; A2010AR001 （500T）；
品质保证：
所有产品由BioTNT 进行品质保证。
如果客户使用中有任何问题，都可以联系BioTNT公司。
电话: 4008801880 或0086 21 51692391 传真： 0086 21 51692391
技术服务专线: 0086 21 54097875-2402,2403
Email: BioTNT@BioTNT.com 主页： www.BioTNT.com
在线支持QQ群： 47468567
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