IF 13.3| BioTNT助力生物医学研究：LAMP2-FLOT2相互作用增强自噬体-溶酶体融合，以在ILC2应答中保护脓毒症心脏
2025年5月，上海交通大学医学院附属上海胸科医院在国际期刊《Autophagy》上发表的，题为“LAMP2-FLOT2 interaction enhances autophagosome-lysosome fusion to protect the septic heart in response to ILC2”的论文。Rongjiao Shao,Weizhuo Liu,Yuxiao Feng同位第一作者，Bin He, Xumin Hou为通讯作者。
背景：脓毒症是由感染或损伤引起的失调性宿主反应导致的器官功能障碍综合征，其仍然是重症监护病房中发病率和死亡率的主要原因。心血管系统是受脓毒症休克严重影响的主要器官之一。尽管多种介质和途径与脓毒症相关的心脏功能障碍有关，但其潜在机制尚未完全阐明。广泛接受的观点是，脓毒症是由失调的免疫反应驱动的，多项临床试验的结果显示，调节这种免疫反应可以改善脓毒症的预后，甚至降低死亡率。因此，了解宿主免疫反应的变化对于开发治疗脓毒症相关心脏功能障碍的新策略至关重要。2 型先天淋巴细胞（ILC2）作为先天免疫系统的一部分，介导 2 型细胞因子（IL-5、IL-13、IL-4、IL-9）的分泌，作为组织稳态和修复的重要调节因子。已发现 ILC2 在响应不同黏膜器官损伤（如肺和肠道）时能迅速激活。值得注意的是，大量研究表明 ILC2 在异质性心脏疾病的炎症过程中具有保护作用。
研究信息：本研究旨在阐明 ILC2 在调节脓毒症进展中心脏功能障碍中的作用。进一步研究表明，IL-4 主要由 ILC2 在响应脓毒症时分泌，可减轻心脏炎症反应并预防心脏内皮细胞死亡。值得注意的是，IL-4 改善了 LAMP2 蛋白表达以稳定溶酶体稳态，并挽救了脓毒症诱导的自噬通量阻断。有趣的是，在 IL-4 暴露后，LAMP2 更倾向于与 flotillin 2（FLOT2）结合，从而在心脏内皮细胞中增强自噬体-溶酶体融合。这些发现为 ILC2 通过自噬调节减轻脓毒症后心脏功能障碍提供了新的视角，并扩展了我们对脓毒症免疫调节的知识。
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IK-1004
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40T/kit
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免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）
用补充了磷酸酶（Roche 4,906,845,001）和蛋白酶（Roche 11,873,580,001）抑制剂的免疫沉淀裂解缓冲液（Sigma-Aldrich 87,787）裂解细胞。用 10 μg 抗 LAMP2 抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-118,822）或对照 IgG（Abclonal, AC005）预先孵育细胞上清液过夜。然后将混合物与蛋白质 A/G 磁珠（BioTNT, IK-1004）在 4°C 下孵育 4 小时。用结合/洗涤缓冲液洗脱免疫沉淀蛋白，并通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离以进行免疫印迹分析或质谱分析。质谱实验和数据处理由浙江 PTM Biolabs 公司完成。
结果：
LAMP2 与 FLOT2 的相互作用对于增强自噬体 - 溶酶体融合以应对 IL4 至关重要。(A)通过 IP-MS 鉴定 IL4 处理后与 LAMP2 相互作用的蛋白。(B) LAMP2 相互作用蛋白的基因本体通路富集图。(C)在 HCMEC 中，IL4 处理 24 小时后 LAMP2-FLOT1 和 LAMP2-FLOT2 相互作用的 IP 分析。(D) 在 HCMEC 中，IL4 处理 24 小时后 FLOT2 和 LAMP2 相互作用的 IP 分析。(E, F) 心脏内皮细胞经 IL4 处理后，LAMP2（红色）和 FLOT2（绿色）双染的代表性免疫荧光图像(E)及定量分析 (F)。细胞核用 DAPI（蓝色）染色。比例尺：20 μm。(G)用于 H 和 I 的 LAMP2 或 FLOT2 突变构建体的示意图。(H) 在 HCMEC 中，共转染 Flag-WT-LAMP2 和 Flag-突变 LAMP2 过表达质粒后，WT-LAMP2 和突变 LAMP2 的共免疫沉淀。用抗 Flag 抗体免疫沉淀外源性正常或突变 LAMP2。(I) 在 HCMEC 中，共转染 Flag-WT-FLOT2 和 Flag-突变 FLOT2 过表达质粒后，WT-FLOT2 和突变 FLOT2 的共免疫沉淀。用抗 Flag 抗体免疫沉淀外源性正常或突变 FLOT2。(J-M) HCMEC 转染 FLOT2 siRNA 和对照 siRNA 后的代表性 western blot 图像 (M)。定量分析各组 HCMEC 中 FLOT2 (J)、SQSTM1/p62 (K)和 LC3 (L)蛋白水平。(N) HCMEC 转染 FLOT2 siRNA 和对照 siRNA 后，显示 StubRFP-sensGFP-LC3 表达的代表性免疫荧光图像。比例尺：20 μm。(O)自噬体（黄色柱）和自噬溶酶体（红色柱）在内皮细胞中的定量分析。数据表示为均值 ± 标准误差（n = 6/组）。F 中采用非配对 Student’s t 检验；J-L 和O中采用单因素方差分析。ns 表示无显著性；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
结论：本研究旨在探讨 ILC2 在脓毒症心脏中通过自噬调节的作用和机制。我们发现，在 CLP 诱导的脓毒症后，ILC2 在心脏中扩增，并伴随 IL4 的显著分泌。心脏中的 ILC2 源性 IL4 防止了心脏内皮细胞（ECs）发生凋亡。IL4 通过 STAT3 激活促进 LAMP2 表达，以调节自噬和溶酶体稳态。重要的是，LAMP2 与 FLOT2 的相互作用对于挽救脓毒症诱导的自噬通量阻断和减轻心脏功能障碍至关重要，为治疗脓毒症心脏提供了新的思路。