IF 3.789| BioTNT助力生物医学研究：酸辅助自组装的芘修饰酪氨酸——通过破裂溶酶体诱导癌细胞凋亡
2024年5月，陕西中医药大学第二临床医学院在国际期刊《RSC Advances》上发表的，题为“Acid-assisted self-assembly of pyrene-capped tyrosine ruptures lysosomes to induce cancer cell apoptosis”的论文。Jing Li为第一作者, Guanying Li,Jiansheng Wang,Jia Zhang为通讯作者。
背景：在癌症细胞中，溶酶体会发生多种改变，如溶酶体生物合成增强、溶酶体酶活性增加以及溶酶体 pH 值变化。这些溶酶体功能的改变对癌症细胞的存活、侵袭和治疗抵抗性有着深远的影响。另一方面，这些改变也呈现出独特的脆弱性，可被用于治疗干预。靶向溶酶体膜的通透性和完整性已被证明是溶酶体靶向治疗中的有效策略之一。特别是在应激条件下，溶酶体膜通透性（LMP）的发生会导致溶酶体内容物泄漏到细胞质中，触发放大的应激反应并导致细胞死亡。分子自组装是一种从底部向上构建大型结构的过程。通过调节自组装过程或刺激，肽组装可在细胞周间空间、细胞膜或细胞质中特异性发生，生成亚细胞器靶向的生物纳米界面，以干扰特定靶标或引发应激反应导致细胞死亡。最近，溶酶体靶向肽自组装也已成功开发。尽管这种方法为溶酶体靶向治疗开辟了道路，但在实现对溶酶体动态的最佳特异性和控制方面仍面临挑战。
研究信息：在这项研究中，我们通过设计基于氨基酸的自组装来实现策略上的范式转变。酪氨酸（Tyr）作为一种天然存在的芳香族氨基酸，能够自组装成有序的纳米结构。然而，在酸性 pH 下，Tyr 带正电荷，无法自组装。为了积极利用 Tyr 的自组装并探索其在 LMP 诱导中的能力，我们在其 N 端引入了一个芘基团，得到了设计分子——1 -丁酰基吡啶修饰的酪氨酸（Py-Tyr）。Py-Tyr 引入了一种新的合成平台，增强了酪氨酸的自组装能力，用于高效诱导 LMP。这种受控的组装过程对溶酶体酸性环境具有特异性响应，确保了精准的靶向性和优化的功能性，从而实现了基于 LMP 的癌症治疗。
使用产品：
|
产品货号
|
产品名称
|
产品规格
|
|
cust-其他引物
|
|
200ul*10um*2
|
定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）
将 A549 细胞以每孔 2×10^5 个细胞的密度接种到 6 孔板中。将细胞置于 37°C、5% CO2 条件下孵育 12 小时以使其贴壁。与 70 μM 的 Py-Tyr 共孵育 6、12 和 24 小时后，收集细胞，并按照制造商的说明使用 RNA 提取试剂盒（SparkJade，中国）提取总 RNA。利用逆转录试剂盒（SparkJade）从 500 ng 总 RNA 中获得 cDNA。使用 SYBR Green qPCR Master Mix（SparkJade）进行 qRT-PCR。采用两步法完成 PCR 循环：首先在 94°C 下变性 2-3 分钟；然后在 94°C 下变性 5-10 秒，退火温度为 55-60°C，持续 10-20 秒，在 72°C 下延伸 20-30 秒。利用 2-ΔΔCT 法计算相对基因表达量，并以 β-actin 作为参考基因进行标准化。引物购自 BioTNT，所用的 Caspase-3、Caspase-8、Bcl2、Bax 和 β-actin 的引物序列如下：
Caspase-3：5′-GGAAGCGAATCAATGGACTCTGG-3′(F)，5′-GCATCGACATCTGTACCAGACC-3′(R)；
Caspase-8：5′-TTTCTGCCTACAGGGTCATGC-3′(F)，5′-TGTCCAACTTTCCTTCTCCCA-3′(R)；
Bcl2：5′-ATCGCCCTGTGGATGACTGAGT-3′(F)，5′-GCCAGGAGAAATCAAACAGAGGC-3′(R)；
Bax：5′-TCAGGATGCGTCCACCAAGAAG-3′(F)，5′-TGTGTCCACGGCGGCAATCATC-3′(R)；
β-Actin：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′(F)，5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′(R)。
结果：
由 Py-Tyr 引起的溶酶体破裂和细胞凋亡。（a）展示由 Py-Tyr 诱导的溶酶体破裂及凋亡激活过程的示意图。（b）未经处理的 A549 细胞及经 70 μM Py-Tyr 处理 24 小时后的 A549 细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，显示猫hepsin B（红色）和溶酶体（绿色）。还展示了 Py-Tyr 聚集体的荧光图像（蓝色）。比例尺代表 10 微米。（c）使用 FITC-Annexin V 和 PI 共染色法，对经 70 μM Py-Tyr 处理 24 小时的 A549 细胞凋亡情况进行流式细胞术分析。（d）对经 70 μM Py-Tyr 处理 0、6、12 和 24 小时的 A549 细胞中与凋亡相关的基因进行 qRT-PCR 分析，数据为均值 ± 标准差，n = 6；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。
结论：综上所述，本研究引入了芘基修饰酪氨酸（Py-Tyr）这一概念验证分子，它通过基于氨基酸的自组装来诱导溶酶体膜通透性（LMP），并实现了针对溶酶体的癌症治疗。Py-Tyr 展现出依赖 pH 值的自组装特性：在生理 pH 值下，它自组装成纳米颗粒；而在酸性环境中，Py-Tyr 发生质子化，电荷排斥作用减弱，进而聚集形成微米级聚集体。这种受控的组装过程对溶酶体的酸性环境具有特异性响应，从而增强了对溶酶体的靶向性，并有效诱导 LMP。细胞实验结果显示，Py-Tyr 能够在溶酶体中特异性积累并导致溶酶体破裂，将溶酶体内容物（如猫hepsin B）释放到细胞质中。猫hepsin B 的泄漏最终激活了细胞凋亡，凸显了 Py-Tyr 在溶酶体靶向癌症治疗中的疗效。本研究证明了基于氨基酸的自组装是一种独特且多功能的 LMP 诱导平台。进一步探索氨基酸的筛选将有助于实现其全部治疗潜力。