IF 3.776| BioTNT助力生物医学研究：抑制 mTORC1 信号通路能够改善脂肪组织纤维化
2023年11月，上海中医药大学第七人民医院在国际期刊《Heliyon》上发表的，题为“Inhibition of the mTORC1 pathway alleviates adipose tissue fibrosis”的论文。Sa Gong,Chang Li为第一作者, Hongli Zhang,Xiaohua Li为通讯作者。
背景：肥胖是一种由脂肪组织过度积累和异常分布引起的慢性进行性疾病，其主要表现为体重增加和全身能量代谢紊乱，并与心血管、呼吸、神经等多系统疾病相关。据世界卫生组织统计，2016年全球有超过6.5亿成年人肥胖，预计到2030年这一数字将上升至10亿。目前，针对肥胖的安全有效预防和治疗策略有限，因此进一步明确肥胖预防和治疗的细胞和分子机制至关重要。脂肪组织是一个高度动态的器官，会不断重塑以适应与肥胖相关的不断变化的代谢环境。当营养物质过剩时，脂肪细胞储存多余脂质直至达到氧扩散极限。最初，缺氧微环境会诱导血管生成并转移细胞外基质（ECM）的灵活性，促进脂肪组织健康扩张以减少缺氧。然而，随着这种状态的持续，由于持续缺氧，会引发慢性低度炎症、纤维化、细胞衰老和脂肪细胞坏死，最终导致不健康的脂肪组织重塑，这是肥胖特征性全身代谢紊乱的主要原因。脂肪组织纤维化是严重肥胖的重要特征，也是逆转肥胖的关键障碍，但其分子机制尚不清楚。
研究信息：在本研究中，我们假设抑制 mTORC1 通路可以改善脂肪组织纤维化。我们利用雷帕霉素抑制肥胖小鼠的 mTORC1 表达，发现雷帕霉素在体内逆转了脂肪纤维化的形态和纤维化基因表达。然后，我们使用经促纤维化药物处理的前脂肪细胞来探索 mTORC1 逆转脂肪纤维化的机制。我们证明了 mTORC1 在蛋白、mRNA 和免疫荧光水平上逆转了与脂肪组织纤维化相关的基因表达。本研究阐明了 mTORC1 通路在缓解脂肪组织纤维化中的作用，可能为肥胖治疗提供一种方法。
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A20120A0703
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2.4 Western blotting 实验
采用 BCA 蛋白测定法（Beyotime，上海）测定细胞或脂肪组织裂解液中蛋白的浓度。将 20 μg 蛋白样品在 8% 的 SDS?PAGE 凝胶中通过电泳分离后，转移到聚偏氟乙烯膜上，接着按照细胞信号技术公司（CST）提供的方案进行免疫印迹。利用 ECL Advance（CST）对印迹膜进行显色，并采用 LAS-4000 超级 CCD 远程控制科学成像系统（GE）进行图像采集。所用的一抗分别针对以下蛋白：微管蛋白（Sigma，美国）、β-actin（CST，美国）、GAPDH（CST，美国）、磷酸化 S6 核糖体蛋白（PS6）（Ser235/236）（CST，美国）、缺氧诱导因子 1-α（HIF-1α）（CST，美国）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（Abcam，英国）以及金属蛋白酶组织抑制因子 1（TIMP-1）[EPR16616]（Abcam，英国）。所用的二抗分别为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（H + L）（BioTNT，中国）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（H + L）（Bio TNT，中国）。
结果：
mTORC1 通路的抑制可减轻 ob/ob 小鼠的脂肪纤维化A、B：用雷帕霉素（0、0.5 mg/kg/天）对 ob/ob 小鼠处理 14 天后，各组（每组 5 只）小鼠的体重（克）（A）和禁食血糖（毫摩尔 / 升）（B）情况。C：代表性 Western blot 图显示用雷帕霉素（0、0.5 mg/kg/天）对 ob/ob 小鼠处理 14 天后，其附睾脂肪组织（EAT）中磷酸化 S6 蛋白水平；对条带强度进行密度测量分析，以微管蛋白为参照，并以载体组进行标准化。D、E：用雷帕霉素（0、0.5 mg/kg/天）对 ob/ob 小鼠处理 14 天后，其附睾脂肪组织（EAT）Masson's 三色染色（胶原蛋白呈蓝色）和 Sirius Red 染色（胶原蛋白呈红色）的代表性图像及定量分析。数据以均值 ± 标准误差（mean ± SEM）表示。*P < 0.05，*P < 0.01，*P < 0.001。P 值（95% 置信区间）通过双尾 t 检验确定。
CoCl? 诱导缺氧以启动脂肪前体细胞纤维化A：代表性 Western blot 图显示经 CoCl?（0、50、100、200、400、800 μM）处理 24 小时的脂肪前体细胞中 HIF-1α 蛋白水平。以 β-actin 作载量对照。对条带强度进行密度测量分析，以 β-actin 为参照，并以 CoCl?（0 μM）组进行标准化。B - F：经 CoCl?（0、100、200 μM）处理 12 和 24 小时的脂肪前体细胞中 Smad2、Smad3、Smad4、TGF-β1、Col1a1、Loxl2、LOX 和 Mmp3 的 mRNA 表达情况（n = 4）。G：脂肪前体细胞经 CoCl?（0、100 μM）处理 12 小时或 24 小时后，用 α-SMA（绿色）染色及 DAPI（蓝色）染细胞核。以 α-SMA 应力纤维阳性细胞的百分比量化纤维化激活程度。独立实验重复 3 次，结果相似。数据以均值 ± 标准误差（mean ± SEM）表示。*P < 0.05，*P < 0.01，*P < 0.001。P 值（95% 置信区间）通过单因素方差分析（one - way ANOVA）确定。
抑制 mTORC1 可逆转缺氧诱导的脂肪纤维化A、B：代表性 Western blot 图显示在无或有 CoCl?（100 μM）存在下，经雷帕霉素（0、5、10、50 nM）处理 24 小时的脂肪前体细胞中 S6 及 HIF-1α 的磷酸化水平。以 β-actin 和微管蛋白作载量对照。对条带强度进行密度测量分析，以确定 PS6 和 HIF-1α 的相对水平。C - F：在无或有 CoCl?（100 μM）存在下，经雷帕霉素（0、5、50 nM）处理 12 小时的脂肪前体细胞中 Col1a1、Loxl2、LOX 和 Mmp3 的 mRNA 表达情况（n = 4）。G：在无或有 CoCl?（100 μM）存在下，经雷帕霉素（0、5、50 nM）处理 24 小时的脂肪前体细胞，用 α-SMA（绿色）染色及 DAPI（蓝色）染细胞核。以 α-SMA 应力纤维阳性细胞的百分比量化纤维化激活程度。独立实验重复 3 次，结果相似。数据以均值 ± 标准误差（mean ± SEM）表示。*P < 0.05，*P < 0.01，*P < 0.001，通过双尾 t 检验确定 P 值（95% 置信区间），与未添加 CoCl? 的样本相比。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，通过单因素方差分析确定 P 值（95% 置信区间），与对照样本相比。
TGF-β1 诱导脂肪前体细胞纤维化A：代表性 Western blot 图及条带强度的密度测量分析，显示经 TGF-β1（0、5、10、50 ng/ml）处理 24 小时的脂肪前体细胞中 TIMP-1 和 α-SMA 的蛋白水平。以 GAPDH 作载量对照。B - F：经 TGF-β1（5 ng/ml）处理 24 和 48 小时的脂肪前体细胞中 Smad3、Col1a1、Loxl2、LOX 和 TIMP-1 的 mRNA 表达情况（n = 4）。F：经 TGF-β1（0.5 ng/ml）处理 24 小时或 48 小时的脂肪前体细胞，用 α-SMA（绿色）染色及 DAPI（蓝色）染细胞核。以 α-SMA 应力纤维阳性细胞的百分比量化纤维化激活程度。独立实验重复 3 次，结果相似。数据以均值 ± 标准误差（mean ± SEM）表示。*P < 0.05，*P < 0.01，*P < 0.001，通过双尾 t 检验确定 P 值（95% 置信区间），与载体组对比。
抑制 mTORC1 可改善 TGF-β1 诱导的脂肪纤维化A、C：代表性 Western blot 图及条带强度的密度测量分析，显示在无或有 TGF-β1（5 ng/ml）存在下，经雷帕霉素（0、5、10、50 nM）处理 24 小时的脂肪前体细胞中 S6 及 HIF-1α 的磷酸化水平。以 β-actin 和微管蛋白作载量对照。B、D - F：在无或有 TGF-β1（5 ng/ml）存在下，经雷帕霉素（0、5、50 nM）处理 24 小时的脂肪前体细胞中 Smad3、Col1a1、Loxl2、LOX 和 Mmp3 的 mRNA 表达情况（n = 4）。G：在无或有 TGF-β1（5 ng/ml）存在下，经雷帕霉素（0、5、50 nM）处理 24 小时的脂肪前体细胞，用 α-SMA（绿色）染色及 DAPI（蓝色）染细胞核。以 α-SMA 应力纤维阳性细胞的百分比量化纤维化激活程度。独立实验重复 3 次，结果相似。数据以均值 ± 标准误差（mean ± SEM）表示。*P < 0.05，*P < 0.01，*P < 0.001，通过双尾 t 检验确定 P 值（95% 置信区间），与未添加 CoCl? 的样本相比。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，通过单因素方差分析确定 P 值（95% 置信区间），与对照样本相比。
结论：mTORC1 直接改善肥胖诱导的脂肪纤维化，在肥胖诱导的纤维化进程中发挥关键作用。我们发现了预防和治疗脂肪组织纤维化的新靶点。未来，我们将持续研究 mTORC1 抑制对两种纤维化脂肪前体细胞的影响，还会探索 mTORC1 在肥胖引发的其他组织纤维化以及衰老等因素导致的脂肪纤维化中的作用机制。