IF 3.857| BioTNT助力生物材料研究：锰植入钛通过调节骨髓间充质干细胞与巨噬细胞之间的相互作用来促进成骨作用
2023年8月，中国科学院上海硅酸盐研究所在国际期刊《Journal of Functional Biomaterials》上发表的，题为“Manganese-Implanted Titanium Modulates the Crosstalk between Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Macrophages to Improve Osteogenesis”的论文。Kuicai Ye为第一作者, Yuqin Qiao为通讯作者。
背景：骨结合过程是一种化学键在生物材料与骨组织之间形成的极为复杂且动态的机制。炎症反应在受损骨组织的修复与重建过程中发挥关键作用，涉及一系列极为复杂的细胞与分子相互作用。近来，调节免疫反应已被视为调控或控制骨重塑过程的关键策略，并为骨生物医学器械的发展带来了前景与挑战。越来越多的证据表明，骨结合是由免疫微环境中的各种因素复杂相互作用所介导的，并且不足的炎症也可能导致骨结合缓慢或骨 - 植入物接触不良。此外，体外和体内研究结果不一致的情况也十分常见，这表明调节材料在免疫微环境中调控成骨活性的能力的机制尚未被充分了解。因此，有必要研究生物材料介导的免疫细胞与骨细胞之间的相互作用在成骨过程中的作用。一些营养元素已被发现对骨再生与重塑发挥关键作用，并能引发显著的免疫反应。在这些元素中，锰作为多种酶促反应的辅助因子，对许多酶的正常功能至关重要。相比之下，锰在调节免疫反应方面的作用比在骨代谢方面更为显著。越来越多的证据表明，锰是一种免疫刺激剂，通过 cGAS - STING 信号通路增强炎症反应。尽管已有一些关于含锰生物材料可刺激成骨细胞或间充质干细胞成骨分化的研究报道，但关于含锰生物材料在免疫微环境中如何影响成骨活性的研究证据仍然很少。因此，本研究进一步探讨锰在调节免疫系统方面的成骨效应。
研究信息：在本研究中，我们采用等离子体浸没离子注入与沉积（PIII&D）技术将锰引入钛表面。这种方法的优势在于它能够将元素引入各种形状不规则的医疗器械中，并将其他可能影响生物性能的混淆因素降至最低。在我们的研究中，由于 Raw264.7 巨噬细胞系易于培养且表型稳定性强，我们选用它来研究材料对细胞免疫反应的影响。在受到诸如脂多糖（LPS）等刺激物的刺激时，Raw264.7 细胞能够引发强烈且广为人知的炎症反应，这通常用于筛选生物材料并预测其调节免疫反应的潜力。这或许最终会激活一系列事件，包括促炎和抗炎细胞因子的产生，这些细胞因子可作为生物标志物用于筛选可能具有抗炎和免疫调节作用的化合物或生物材料。我们开展了 Raw264.7 细胞与小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的单培养和共培养实验，以加深对锰植入表面介导的巨噬细胞与 mBMSCs 之间的相互作用的理解。
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cust-其他引物
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200ul*10um*2
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2.3.6 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析
采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测免疫及成骨相关基因表达。将每组 4 个样品置于 24 孔板中，分别接种密度为每孔 1×10? 个的 Raw264.7 细胞和密度为每孔 2×10? 个的小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）。Raw264.7 细胞培养 4 天，mBMSCs 培养 10 天。培养结束后，将样品移至新的六孔板，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次，随后用 1 mL TrizolTM（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）将贴壁细胞吹脱。按照制造商协议，利用转录酶第一链 cDNA 合成试剂盒（Roche，瑞士巴塞尔市）从总 RNA 合成互补 DNA（cDNA）。采用 LightCycler® 480 system II（Roche，瑞士巴塞尔市）和 SYBR Green I Master（Roche，瑞士巴塞尔市）进行 RT-qPCR。利用 2−ΔΔCt 法计算每个目标基因水平，并以 GAPDH 作为标准化参考。RT-qPCR 所用引物见表 S1，引物由 BioTNT（中国上海市）提供。每个样品组均进行三次重复分析。
结果：
在不同样品上单培养的 Raw264.7 细胞孵育 4 天后的结果：（a）细胞活性；（b）扫描电子显微镜（SEM）下的形态；（c）免疫荧光染色图像；（d）流式细胞术分析；（e）相关基因的相对 mRNA 表达水平。
在不同样品上单培养的小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）孵育 10 天后的成骨活性：（a）F -肌动蛋白丝的图像；（b）细胞活性测定；（c）相关基因的相对 mRNA 表达水平；（d）碱性磷酸酶（ALP）染色图像及定量结果；（e）胶原蛋白分泌及定量结果；（f）细胞外基质矿化及定量结果。
在不同样品上共培养 10 天后的小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的成骨活性：（a）成骨相关基因的相对 mRNA 表达水平；（b）碱性磷酸酶（ALP）染色及定量结果；（c）胶原蛋白分泌染色及定量结果；（d）细胞外基质矿化染色及定量结果。
在不同样品上共培养 4 天的 Raw264.7 细胞：（a）扫描电子显微镜（SEM）下的形态；（b）免疫荧光染色图像；（c）相关基因的相对 mRNA 表达水平。
结论：在本研究中，我们采用等离子体浸没离子注入与沉积（PIII&D）技术，成功将锰引入钛板表面，并对物理化学性质的变化进行了表征。研究表明，经锰处理的表面，尤其是 Mn120 样本，在 pH 为 7.4 时表面 ζ 电位升高，且在 110 纳米范围内表面纳米硬度增强。虽然锰的引入在单培养条件下会刺激巨噬细胞的 M1 表型，对小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）影响较小，但却能通过调节 mBMSCs 与巨噬细胞之间的相互作用，提高细胞的成骨分化能力。因此， manganese - modified materials（锰改性材料）有望通过免疫调节促进骨组织形成。