IF 4.659| BioTNT助力生物医学研究：过氧化氢刺激的脂肪来源干细胞外泌体可减轻糖尿病骨髓间充质干细胞的衰老并恢复其成骨能力
2023年12月，郑州大学第一附属医院在国际期刊《Drug Design, Development and Therapy》上发表的，题为“Extracellular Vesicles Derived from H2O2-Stimulated Adipose-Derived Stem Cells Alleviate Senescence in Diabetic Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Restore Their Osteogenic Capacity”的论文。Yu Li为第一作者，Ximei Wang为通讯作者。
背景：糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，其发病率在全球范围内不断上升。据预测，到2045年，糖尿病患者人数将超过7亿。长期高血糖会严重扰乱骨代谢，使糖尿病患者更容易发生骨折，并且常常导致愈合延迟或不愈合。不幸的是，虽然传统的骨修复方法对非糖尿病患者有效，但在糖尿病患者中往往无法取得满意的疗效。因此，开发创新的治疗方法以修复糖尿病患者的骨缺损已成为一个特别有趣的研究领域。近年来，间充质干细胞（MSCs）的移植因其具有较高的增殖活性、强大的成骨潜力和易于获取而成为骨修复的一种有前景的策略。临床前动物实验和临床试验的证据均表明，MSCs能够改善成骨微环境并促进新骨形成。然而，与健康供体相比，糖尿病患者来源的MSCs显示出生存能力降低、多向分化能力受损以及旁分泌功能减弱。此外，接受糖尿病MSCs治疗的动物与接受正常MSCs治疗的动物相比，骨形成也较少。糖尿病MSCs的再生潜能受损已成为干细胞疗法在糖尿病骨再生临床应用中的巨大障碍。
研究信息：本研究旨在比较H?O?刺激的脂肪来源干细胞（ADSCs）衍生的EVs与未处理ADSCs衍生的EVs对糖尿病骨髓间充质干细胞（BMSCs）的衰老和成骨潜能的影响。从2型糖尿病大鼠中收集糖尿病BMSCs，并评估EV预处理对其生存能力、迁移、成骨分化和衰老的影响。此外，为了探讨EV预处理有益效果的机制，通过Western blotting检测了Nrf2/HO-1信号通路。此外，将用EVs预处理的糖尿病BMSCs植入5毫米大鼠颅骨缺损中，观察其体内成骨潜能和抗衰老功能。
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cust-其他引物
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200ul*10um*2
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实时聚合酶链反应（PCR）
在特定的时间间隔，向六孔板的每个孔中加入Trizol®试剂（Aladdin，中国上海），然后将六孔板置于冰上。轻轻摇晃混合物一分钟，然后按照Beyotime公司的RT试剂盒说明书收集混合物以合成cDNA。从BioTNT（BioTNT，中国上海）购买了包括P16、P21、P53、与runt相关的转录因子2（RUNX2）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OCN）、I型胶原蛋白（COL1）和GAPDH在内的几种基因的引物，引物列表见表1。热循环协议包括在95°C下初始变性5分钟，然后进行40个循环，每个循环包括在95°C下变性30秒、在58°C下退火30秒以及在72°C下延伸45秒。使用2-ΔΔCq方法计算相对mRNA表达量，以GAPDH基因为内参基因。
结果：
用H-EVs预处理增强了糖尿病BMSCs中成骨相关基因和蛋白的表达。（A）通过PCR检测BMSCs中RUNX2、COL1、OCN和OPN的基因表达（n=5）。（B）通过Western blotting检测BMSCs中RUNX2、COL1和OCN的蛋白表达。（C）RUNX2、COL1和OCN含量的半定量分析（n=5）。（D）通过免疫荧光染色检测MSCs中OPN的水平（比例尺：100微米）。
H-EVs预处理减轻了糖尿病BMSCs的衰老。（A）衰老相关β-半乳糖苷酶（SA β-gal）染色的代表性图像（比例尺：100微米）。（B）通过定量分析 β-gal 阳性BMSCs（n=6）。（C）通过PCR检测与衰老相关基因P16、P21和P53的表达（n=6）。（D）通过免疫荧光染色检测MSCs中OPN的水平。（E）P21阳性细胞比例的定量分析（n=5，比例尺：100微米）。
结论：本研究结果表明，H?O?预处理的脂肪来源干细胞外泌体（EVs）有望成为增强糖尿病骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨再生能力的有效工具。用H?O?刺激的EVs预处理的糖尿病BMSCs显示出改善的细胞生存能力、迁移和成骨分化能力，同时细胞氧化应激和衰老水平降低。H?O?刺激的EVs对糖尿病BMSCs行为的有益影响可能归因于Nrf2/HO-1通路的激活。我们希望这些发现能为糖尿病骨再生中自体BMSCs移植的临床应用铺平道路。