IF 4.817| BioTNT助力生物医学研究：小檗碱通过诱导棕色脂肪细胞分泌GDF15改善肥胖
2023年4月，上海中医药大学附属第七人民医院在国际期刊《Endocrinology》上发表的，题为“Berberine Ameliorates Obesity by Inducing GDF15 Secretion by Brown Adipocytes”的论文。Chang Li,Qingyang Leng,Lihua Li同位第一作者，Hongli Zhang,Xiaohua Li为通讯作者。
背景：肥胖是由脂质沉积引起的，这是由于能量摄入和消耗之间的不平衡。肥胖与心血管疾病以及呼吸系统、神经系统等多系统疾病的发病和发展密切相关。肥胖还与全因死亡率高有关。据世界卫生组织统计，2016年全球有6亿人肥胖。迫切需要找到低风险的治疗方法。然而，目前临床药物对肥胖的治疗效果有限。小檗碱（BBR）是一种从中药黄连中提取的天然植物异喹啉生物碱，广泛用于治疗胃肠道感染。随着对BBR药理机制的进一步研究，发现BBR对代谢的益处是多方面的。BBR可以通过多种方式改善肥胖，例如减少食欲、促进米色脂肪组织和棕色脂肪组织的产热、改善葡萄糖代谢、调节短链脂肪酸的产生、上调胰高血糖素样肽的表达以及调节肠道微生物群。迄今为止，已经提出了BBR减轻体重的分子机制，包括激活5'AMP激活的蛋白激酶、胰高血糖素样肽-1、神经肽Y和解耦联蛋白1（UCP1），以及抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ和C/EBPα的功能。然而，BBR减轻体重的靶点和机制仍然不清楚。
研究信息：在本研究中，我们发现BBR增加了饮食诱导肥胖（DIO）小鼠血清中GDF15的水平，且GDF15水平与体重增加程度呈负相关。在进一步的研究中，我们探索了BBR诱导GDF15产生的组织来源和机制。我们确定棕色脂肪组织（BAT）是DIO小鼠暴露于BBR后GDF15水平增加的主要来源之一，并证明GDF15的产生受到整合应激反应（ISR）的调控。此外，我们还证实BBR诱导的棕色脂肪细胞产热在体外与GDF15无关。本研究阐明了BBR诱导GDF15分泌的作用及其潜在机制，为使用BBR促进减肥提供了新的理论依据。
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A20120A0703
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Western Blotting
使用RIPA裂解缓冲液（Beyotime，P0013B）提取蛋白样本，该缓冲液补充了磷酸酶抑制剂（Roche，4906845001）和蛋白酶抑制剂（Roche，04693132001）。随后，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度后，将样本储存于-80℃。根据不同蛋白的分子量，选择8-12%的SDS-PAGE凝胶，并以80V的电压运行2小时以分离蛋白。随后，将蛋白转移至NC膜上，并用5%脱脂奶粉封闭1小时。使用的一抗特异性针对以下蛋白：热休克蛋白90（Cell Signaling Technology（CST），Cat#ab4874，RRID: AB_2121214）、免疫球蛋白结合蛋白（CST，Cat#ab3177，RRID: AB_2119845）、内质网氧化还原酶1α（CST，Cat#ab3264，RRID: AB_823684）、PKR样内质网激酶（PERK）（CST，Cat#ab5683，RRID: AB_10841299）、IRE1α（CST，Cat#3294，RRID: AB_823545）、C/EBP同源蛋白（CHOP）（CST，Cat#ab2895，RRID: AB_2089254）（内质网应激抗体样本试剂盒）（CST，9956）、ATF-4（D4B8）（CST，Cat#ab11815，RRID: AB_2616025）、真核翻译起始因子2A（eIF2α）（CST，Cat#ab9722，RRID: AB_2230924）和磷酸化eIF2α（Ser51）（CST，Cat#ab9721，RRID:AB_330951）。将膜与这些抗体在4℃下孵育过夜。使用的二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（BioTNT，Cat# A20120A0704，RRID:AB_2924777）和HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（Bio TNT，Cat# A20120A0703，RRID:AB_2924776）。使用Image Quant LAS4000成像系统（GE Healthcare，USA）捕获免疫印迹图像。
结果：
小檗碱通过激活棕色脂肪细胞中的整合应激反应（ISR）增加GDF15分泌（A）用小檗碱（0、1?μM）处理成熟的原代棕色脂肪细胞6、12和24小时后，ATF4和CHOP的表达情况（n = 4）。（B、C）代表性Western blot显示用小檗碱（1?μM）处理0、0.5、1和3小时的成熟原代棕色脂肪细胞中BIP、ERO1L、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP和HSP90的蛋白水平。HSP90用作加载对照。与HSP90相对的条带强度的光密度分析，并以0小时组进行标准化。（A、C）数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。*P < .05，**P < .01，***P < .001。P值（95%置信区间）通过单因素方差分析（1-way ANOVA）确定。（D）用小檗碱（1?μM）处理12小时，有或没有ISRIB（0.2?μM）存在时，成熟原代棕色脂肪细胞中ATF4和CHOP的表达情况（n = 5）。（E、F）用小檗碱（1?μM）处理0、0.5、1和3小时，有或没有ISRIB（0.2?μM）存在时，成熟原代棕色脂肪细胞中p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP和HSP90的蛋白水平。HSP90用作加载对照。与HSP90相对的条带强度的光密度分析，并以对照样本进行标准化。（G）用小檗碱（1?μM）处理12小时，有或没有ISRIB（5?μM）存在时，成熟原代棕色脂肪细胞中GDF15 mRNA的表达情况（n = 4）。（H）用小檗碱（1?μM）处理24小时，有或没有ISRIB（5?μM）存在时，成熟原代棕色脂肪细胞上清液中GDF15的蛋白水平（n = 6）。（D、F、G、H）数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。*P < .05，**P < .01，***P < .001。P值（95%置信区间）通过单因素方差分析（1-way ANOVA）相对于对照样本确定。#P < .05，##P < .01，###P < .001。P值（95%置信区间）通过双尾t检验相对于小檗碱处理样本确定。
结论：本研究表明BBR通过激活棕色脂肪细胞中的ISR诱导GDF15分泌，最终抑制食欲并促进体重减轻。我们为BBR作为棕色脂肪细胞中GDF15表达的新诱导剂，以及棕色脂肪细胞功能的进一步研究提供了新的理论基础。本研究将支持进一步研究脂肪细胞分泌的BBR诱导的GDF15在改善肥胖中的具体作用以及潜在机制。