IF 5.555| BioTNT助力生物医学研究：小胶质细胞P2Y12信号通路通过脊髓中IL-18介导的中枢敏化作用促进顺铂诱导的疼痛高敏反应
2023年5月，江苏省盐城市第一人民医院在国际期刊《The Journal of Pain》上发表的，题为“Microglial P2Y12 Signaling Contributes to Cisplatin-induced Pain Hypersensitivity via IL-18-mediated Central Sensitization in the Spinal Cord”的论文。Xue-Tai Chen, Li-Ping Chen同位第一作者，Wen Shen为通讯作者。
背景：化疗引起的外周神经病变（CIPN）是由广泛使用的抗肿瘤药物引起的常见不良事件。顺铂是一种铂类化疗药物，广泛用于多种肿瘤的治疗。与几种其他化疗药物类似，顺铂的副作用是进展性和不可逆的，例如疼痛性周围神经病变。这些治疗相关症状会降低患者的生活质量，常常导致治疗剂量减少或治疗中断。然而，目前可用于顺铂诱导疼痛高敏反应的治疗方法相对有限。
研究信息：本研究发现重复顺铂治疗显著上调脊髓中 P2Y12 的表达，且 P2Y12 主要表达于小胶质细胞。抑制 P2Y12 表达可明显减轻顺铂诱导的疼痛高敏反应，同时阻断 P2Y12 信号通路也能抑制顺铂诱导的小胶质细胞过度活跃。进一步研究发现，小胶质细胞 Src 家族激酶 /p38 通路通过促进脊髓中促炎细胞因子 IL-18 的产生，在 P2Y12 介导的顺铂诱导疼痛高敏反应中发挥重要作用。阻断 P2Y12/IL-18 信号通路能够逆转顺铂诱导的疼痛高敏反应以及 N- 甲基 - D - 天冬氨酸受体的激活和随后的 Ca2+ 依赖性信号。综上所述，我们的研究数据表明，小胶质细胞 P2Y12 - SFK - p38 信号通路通过 IL - 18 介导的脊髓中枢敏化作用促进顺铂诱导的疼痛高敏反应，P2Y12 有望成为预防化疗诱导疼痛高敏反应的干预靶点。
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cust-其他引物
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200ul*10um*2
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实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）
根据制造商的说明，使用 TRIzol 试剂（Invitrogen）从 L4-6 脊髓背角组织中提取总 RNA。随后，使用 PrimeScript RT Master Mix（RR036A；Takara，日本）将 1 μg 总 RNA 逆转录为 cDNA。每个反应使用 SYBR Premix Ex Taq 套装（RR420A；Takara）进行三次重复，最终体积为 20 μL，包含 2 μL cDNA 和 10 μM 的基因特异性引物。在 7,300 Plus 实时 PCR 系统（Applied Biosystems，美国）上进行 RT-PCR，热循环条件为：95°C 30 秒，随后进行 40 个扩增循环（95°C 5 秒和 60°C 30 秒）。使用 2−??Ct 方法分析 mRNA 表达水平，以甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶作为内源性对照。本实验所用引物序列（BioTNT，中国）见表 3。
结果：
脊髓阻断P2Y12/Src家族激酶（SFK）/p38通路可抑制顺铂诱导的IL-18生成。(A) IL-18免疫反应性与IBA-1（小胶质细胞标记物）共定位，(B)但未与NeuN（神经元标记物）或GFAP（星形胶质细胞标记物）在脊髓背角共定位。(C) IL-18免疫反应性与P2Y12、p-SFK（磷酸化SFK）及p-p38（磷酸化p38）在脊髓背角共定位。组织于首次顺铂注射后第15天采集。比例尺：50 μm和20 μm（放大视图）。(D–F)实时定量PCR分析显示，鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395（D）、SFK抑制剂PP2（E）或p38抑制剂SB239063（F）均显著抑制顺铂诱导的脊髓背角IL-18 mRNA表达上调。(G–I) Western blot分析表明，MRS2395（G）、PP2（H）或SB239063（I）显著降低顺铂诱导的IL-18蛋白表达。实验设计：MRS2395（2 μg）、PP2（10 μg）、PP3（PP2的非活性类似物，10 μg）或SB239063（10 μg）于首次顺铂注射后第12、13、14、15天每日鞘内注射一次，组织于第15天末次注射后4小时采集。数据以均值±标准误（SEM）表示，**P < 0.01（与生理盐水+DMSO或PP3组相比）；##P < 0.01（与顺铂+DMSO或PP3组相比），n=4/组，单因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett事后检验。
缩写： ANOVA（方差分析）；DMSO（二甲基亚砜）；GFAP（胶质纤维酸性蛋白）；IBA-1（离子钙结合适配分子1）；IL-18（白细胞介素-18）；NeuN（神经元核抗原）；qPCR（定量聚合酶链反应）；SEM（标准误）；SFK（Src家族激酶）。
结论：本研究揭示了 P2Y12 信号在调控顺铂诱导的疼痛高敏反应中通过 IL-18 产生发挥新的作用，这一过程是由脊髓小胶质细胞中 SFK-p38 通路的激活介导的。阻断 P2Y12 信号可能是一种可行的药物治疗手段，用于预防和缓解顺铂诱导的疼痛高敏反应。