IF 5.578| BioTNT助力生物医学研究：包含miR-26a、GSK3β和C/EBPα的调控环路调控人脂肪来源间充质干细胞的成骨分化
2015年10月，上海交通大学医学院第九人民医院眼科在国际期刊《Scientific Reports》上发表的，题为“A regulatory loop containing miR-26a, GSK3β and C/EBPα regulatesthe osteogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells”的论文。Zi Wang, Qing Xie同位第一作者，Ping Gu, Xianqun Fan为通讯作者。
背景：间充质干细胞（MSCs）因其能分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，已成为细胞治疗和组织工程治疗应用的有力工具。目前，已从多种组织（如骨髓、脂肪组织及脐带血等）中分离出 MSCs，用于糖尿病、移植物抗宿主病、心肌梗死和脊髓损伤等多种疾病和损伤的潜在治疗。脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）因易于分离、来源丰富、多能性和快速扩增，在骨再生方面极具潜力。探究 ADSCs 成骨机制的分子基础，有助于深入理解相关调控模式，进而开发更有效的基于细胞的骨缺损修复疗法。
研究信息：本研究通过导入促进或抑制内源性 miR - 26a 的慢病毒表达载体，分析 miR - 26a 对人 ADSCs 成骨的影响，确认 GSK3β 是 miR - 26a 在人 ADSCs 中的直接靶点，并借助功能获得或缺失分析，探究 GSK3β 在人 ADSCs 成骨分化调控中的作用。同时，研究 GSK3β 对 β - 连环蛋白的调控作用，揭示 C/EBPα 是其下游靶点之一，并证实 C/EBPα 可转录调控 miR - 26a 的表达。综上，研究数据表明存在由 miR - 26a、GSK3β 和 C/EBPα 构成的反馈调控环路，可调控人 ADSCs 成骨过程。
使用产品：
|
产品货号
|
产品名称
|
产品规格
|
|
A2030A006
|
|
120T
|
逆转录及定量聚合酶链反应（qPCR）
采用 QIAGEN 公司（美国加利福尼亚州瓦伦西亚市）的 RNeasy Mini Kit 提取各样本的总 RNA，运用 TaKaRa 公司（中国大连市）PrimeScript™ RT 试剂盒（Perfect Real Time）合成第一链互补 cDNA。将所得 cDNA 用无核酸酶水（Invitrogen 公司）稀释 20 倍，作为 qPCR 模板。qPCR 在 20 μl 反应体系中进行，包含 10 μl 反应混合液、2 μl cDNA 以及通过 Primer 3 软件设计的基因特异性引物 300 nM（引物序列见表 1）。利用 7500 实时荧光定量 PCR 仪（美国加利福尼亚州欧文市 Applied Biosystems 公司）开展 qPCR，反应条件为 95 °C 预变性 10 min，随后进行 40 个循环的扩增（95 °C 15 s，60 °C 1 min）。通过将 cDNA 进行梯度稀释（1:1、1:5、1:25、1:125、1:625 和 1:3,125）来测定反应效率。对于 miRNA qPCR，使用 QIAGEN 公司的 RNeasy Mini Kit 提取总 RNA，取 1 μg 总 RNA，采用中国 BioTNT 生物技术公司的 BioTNT miRNA qPCR 检测引物套装中的茎环引物进行逆转录。每个样本均进行三次重复检测。运用 Pfaffl 法分析 mRNA 和 miRNA 的相对基因表达水平，其中以 GADPH 和 U6B 作为内源性对照进行数据标准化处理。
结果：
GSK3β 是 miR - 26a 的直接靶点。（A）Wsetern blot分析显示，miR - 26a 可抑制 GSK3β 蛋白表达水平，而 miR - 26a 抑制剂则使 GSK3β 表达水平上升。（B）qPCR 检测表明，外源性 miR - 26a 和 miR - 26a 抑制剂对 GSK3β mRNA 水平无显著影响。qPCR 数据为三次独立实验的平均值，均以 GADPH 进行标准化。NS 表示无显著性差异。（C）图示展示 GSK3β mRNA 3′非翻译区（3′UTR）4636 - 4643 位点及其突变序列。（D）构建的荧光素酶报告系统示意图，包含野生型或突变型结合位点。（E）双荧光素酶报告基因实验显示，共转染 miR - 26a 和野生型结合位点（GSK3β 3′UTR - wt）可显著降低荧光素酶活性，而 miR - 26a 对突变结合区域（GSK3β 3′UTR - mut）无影响。所有数据为三次独立实验的平均值，荧光素酶活性数据以海肾荧光素酶活性进行标准化。***P < 0.001。
GSK3β 抑制人脂肪来源间充质干细胞（hADSCs）的成骨作用。（A）qPCR 检测显示，转染 si - GSK3β 可使 GSK3β mRNA 水平显著下降。（B）Western blot显示，转染 si - GSK3β 可显著降低 GSK3β 蛋白水平。（C）qPCR 显示，GSK3β 过表达质粒使 GSK3β mRNA 水平显著上升，而转染 si - GSK3β 则使其下降。（D）Western blot得到类似结果，即 p - GSK3β 使 GSK3β 蛋白水平上升，si - GSK3β 则使其下降。（E）定量碱性磷酸酶（ALP）实验显示，p - GSK3β 降低 ALP 活性，而 si - GSK3β 则使其上升。各时间点数据均以 Day 0 的 p - NC 和 si - NC 进行标准化。（F）定量钙实验显示，GSK3β 过表达使钙含量降低，而 si - GSK3β 则使其上升。各时间点数据均以 Day 0 的 p - NC 和 si - NC 进行标准化。数据为三次独立实验的平均值。所有 qPCR 数据均以 GADPH 标准化，p - NC 和 si - NC 分别作为 p - GSK3β 和 si - GSK3β 的阴性对照。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
GSK3β 是人脂肪来源间充质干细胞（hADSCs）成骨作用的负调控因子。（A）qPCR 检测显示，GSK3β 过表达可降低成骨相关基因（如 BSP、Runx2、OPN 和 Ocn）的 mRNA 水平。（B）siRNA 介导的 GSK3β 敲低则促进这些基因的 mRNA 水平。（C）经共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像的细胞免疫荧光显示，GSK3β 过表达抑制 Ostrix、SATB2 和 Runx2 的表达水平，而 GSK3β 敲低则促进其表达。比例尺：100 μm。（D）Western blot分析显示，p - GSK3β 抑制成骨特异性基因（如 Ocn、BSP 和 OPN）的蛋白水平，而 si - GSK3β 则增强其水平。（E）碱性磷酸酶（ALP）和茜素红 S（ARS）染色显示，GSK3β 过表达减少细胞内 ALP 和矿化细胞外基质的存在，而 GSK3β 敲低则使其增加。所有数据为三次独立实验的平均值。所有 qPCR 数据均以 GADPH 标准化；p - NC 和 si - NC 分别作为 p - GSK3β 和 si - GSK3β 的阴性对照。*P < 0.05，**P < 0.01。
GSK3β 调控 β - 连环蛋白及其下游靶标 C/EBPα。（A）Western blot显示，si - GSK3β 使 β - 连环蛋白水平上升，而 p - GSK3β 则使其水平下降。（B）细胞免疫荧光实验显示，转染 si - GSK3β 时，β - 连环蛋白的细胞内含量增加，且从细胞质向细胞核转移；而 GSK3β 过表达则降低 β - 连环蛋白水平。比例尺：50 μm。（C）含 TCF/LEF 反应元件的荧光素酶报告基因实验显示，si - GSK3β 使 β - 连环蛋白 - TCF/LEF 驱动的荧光素酶表达水平上升，而 p - GSK3β 则使其下降。所有数据为三次独立实验的平均值。p - NC 和 si - NC 分别作为 p - GSK3β 和 si - GSK3β 的阴性对照。荧光素酶活性数据以海肾荧光素酶活性标准化。转染 si - β - 连环蛋白可显著降低 β - 连环蛋白的 mRNA（D）和蛋白（G）水平。qPCR 显示，与 si - NC 或未处理的 hADSCs 相比，转染 si - GSK3β 或用 10 mM LiCl 处理 hADSCs 时，C/EBPα 的 mRNA 水平下降（E）；而与 si - NC 或 p - NC 相比，转染 si - β - 连环蛋白或 p - GSK3β 后，C/EBPα 水平上升（F）。Western blot也显示，经 LiCl 处理或转染 si - GSK3β 的 hADSCs 中 C/EBPα 蛋白水平上升（H），而转染 si - β - 连环蛋白或 p - GSK3β 的 hADSCs 中 C/EBPα 蛋白水平下降（I）。所有数据为三次独立实验的平均值，所有 qPCR 数据均以 GADPH 标准化。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
C/EBPα 通过直接结合到其启动子区域来调控 miR-26a。（A）qPCR 检测显示，外源性转染 C/EBPα 可提高 miR-26a 的表达水平；数据以 U6B 标准化。（B）转染 C/EBPα 可促进 CTDSPL 的表达；数据以 GADPH 标准化。（C）构建的两个荧光素酶报告系统示意图，用于评估启动子活性。（D）荧光素酶活性实验显示，共转染 pGL3 - Promoter1 和 p - C/EBPα 可提高荧光素酶表达水平。（E）染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示，启动子区域内的三个片段（CTDSPL 的 ATG 上游 - 2000/-1001 和 - 1000/-1）可被 C/EBPα 免疫沉淀，并通过引物 A（-1580/-1464, 117 bp）、B（-1422/-1301, 122 bp）和 C（-1220/1101, 120 bp）扩增，引物 NC（-1786/-1683, 104 bp）作为阴性对照。ChIP 实验在以下条件下进行：不用抗体（输入），用 C/EBPα 抗体（C/EBPα）和用对照 IgG 抗体（IgG）。（F）示意图表示构建的三个荧光素酶报告系统，部分序列缺失，用于研究 ChIP 实验中被 C/EBPα 免疫沉淀的片段的转录活性。（G）荧光素酶实验显示，共转染 pGL3 - ΔA 和 p - C/EBPα 不再像 pGL3 - ΔB 和 pGL3 - ΔC 那样促进荧光素酶表达。（H）示意图表示含有 C/EBPα 结合位点野生型（-1530/-1526, GCAAG）或突变型（-1530/-1526, ATGGA）的荧光素酶报告系统。（I）荧光素酶实验显示，共转染 pGL3 - 突变型和 p - C/EBPα 不再像 pGL3 - 野生型那样促进荧光素酶表达。数据为三次独立实验的平均值；以海肾荧光素酶活性作为对照，对萤火虫荧光素酶活性进行标准化。*P < 0.05，**P < 0.01。
结论：我们的数据显示，miR-26a 的过表达增强了人脂肪来源间充质干细胞（hADSCs）的成骨作用，而成骨作用受到 miR-26a 敲低的抑制。我们进一步揭示了 miR-26a 通过直接结合 GSK3β mRNA 的 3′非翻译区（UTR）来干扰 GSK3β，GSK3β 作为 hADSCs 成骨的负调控因子。GSK3β 被证明通过调节 β-连环蛋白影响 Wnt 信号通路，进而改变其下游靶标 C/EBPα 的表达。研究发现，C/EBPα 通过物理结合到 CTDSPL 启动子区域来转录激活 miR-26a 的表达。综合来看，我们的数据揭示了一个由 miR-26a、GSK3β 和 C/EBPα 组成的新型反馈调控环路，其功能可能有助于调节 hADSCs 的成骨作用，我们的发现将有助于拓展我们对控制细胞分化精确且复杂调控网络的认识。