IF 6.1| BioTNT助力生物医学研究：神经元DJ-1调控帕金森病中的小胶质细胞激活
2025年3月，上海交通大学医学院附属瑞金医院在国际期刊《Neural Regeneration Research》上发表的，题为“Neuronal DJ-1 regulates microglial activation in Parkinson’s disease”的论文。Aonan Zhao为第一作者，Yang Jiao, Jun Liu, Yuanyuan Li为通讯作者。
背景：帕金森病（PD）是一种影响60岁及以上人群约1%的神经退行性疾病。该疾病主要由黑质（SN）中多巴胺能神经元的逐渐丢失以及主要由α-突触核蛋白组成的路易小体的存在所定义。这些病理标志显著导致PD患者的运动和认知障碍。黑质中的小胶质细胞炎症越来越被认为与PD中的神经退行性病理过程密切相关。越来越多的证据表明，小胶质细胞和神经元之间的功能障碍相互作用可能加剧疾病进展，尽管其精确机制尚不清楚。DJ-1（也称为帕金森病蛋白7）由PARK7基因编码，与一种罕见的常染色体隐性遗传的早发性PD相关。这种多功能蛋白对于维持线粒体稳定性和管理细胞对氧化应激的反应至关重要。近年来，越来越多的关注转向DJ-1在调节神经炎症中的作用，暗示其可能显著影响PD的潜在病理机制。使用DJ-1（PARK7）基因敲除（KO）模型的研究强调，DJ-1的缺失显著增强小胶质细胞激活，涉及NOD样受体家族pyrin结构域含3（NLRP3）炎症体和信号转导子和激活转录因子1（STAT1）信号通路。通过影响炎症介质的释放，DJ-1在促进小胶质细胞的抗炎功能中发挥重要作用。尽管有这些发现，但神经元DJ-1调节小胶质细胞驱动的炎症反应的具体机制在PD中尚不清楚，需要进一步研究以确定治疗机会。
研究信息：本研究旨在探讨DJ-1在调节小胶质细胞-神经元通讯中的作用，以确定帕金森病神经炎症的潜在治疗靶点。研究发现，Park7基因敲除小鼠和Park7基因敲低的SH-SY5Y细胞中，C-X3-C基序趋化因子配体1（CX3CL1）水平显著降低。蛋白芯片分析和GEO数据集验证显示，Park7基因敲除导致CX3CL1和另外两种趋化因子（单核细胞趋化蛋白-1和白细胞介素-8）表达下调。进一步研究发现，Park7缺乏会减少小鼠和SH-SY5Y细胞中神经元内质网中含解整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白10（ADAM10）的处理，从而降低CX3CL1分泌。这随后导致小胶质细胞异常激活，向促炎性M1表型转变，加剧神经炎症反应。这些效应可通过外源性CX3CL1给药来缓解。同时，外源性CX3CL1改善了Park7基因敲除的帕金森病模型小鼠的运动功能，促进黑质中酪氨酸羟化酶阳性神经元的存活，并减少Iba-1阳性小胶质细胞的激活。这些发现表明，DJ-1通过抑制小胶质细胞激活对多巴胺能神经元具有神经保护作用，其机制可能涉及CX3CL1调节。研究表明，以DJ-1/CX3CL1轴为靶点可能是调节神经炎症和保护多巴胺能神经元的新疗法。
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A2010A001
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1ml
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实时聚合酶链式反应
使用 TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific）对小鼠脑组织进行匀浆化处理，并按照制造商的说明从匀浆中提取总 RNA。对总 RNA 进行定量后，将 1 μg 的总 RNA 逆转录为互补 DNA（cDNA），所用试剂盒为 TaKaRa 试剂盒（Takara，日本滋贺县草津市）。将 cDNA 与实时 PCR 预混液（Biotnt）混合，并通过 PCR 阵列进行分析。使用 Applied Biosystems 7500 荧光定量 PCR（qPCR）系统（Thermo Fisher Scientific）进行实时 PCR，以 SYBR Green 混合液（Takara）为反应体系，在 20 μL 的反应体积中检测相应 mRNA 的相对表达水平，所用引物如下：Il-1β 的正向引物为 5′-CTG TGA CTC ATG GGA TGA TGA TG-3′，反向引物为 5′-CGG AGC CTG TAG TGC AGT TG-3′；Il-6 的正向引物为 5′-CTG CAA GAG ACT TCC ATC CAG-3′，反向引物为 5′-AGT GGT ATA GAC AGG TCT GTT GG-3′；Tnf-α 的正向引物为 5′-CTG AAC TTC GGG GTG ATC GG-3′，反向引物为 5′-GGC TTG TCA CTC GAA TTT TGA GA-3′。以 GAPDH 作为参考基因进行数据标准化。
结果：
DJ-1与CX3CL1释放呈正相关。（A、B）对Park7基因敲除（KO）和野生型（WT）小鼠原代中脑神经元的34种趋化因子表达进行PCR分析，结果显示KO小鼠中IP-10、CX3CL1和TECK的表达降低。（C、D）对正常对照组（NC）和Park7 KO小鼠神经元上清液的蛋白质微阵列分析显示，KO小鼠中MCP-1、IL-8、GCP-2、CX3CL1和MCP-2水平受到抑制。（E）SH-SY5Y细胞中CX3CL1水平在Park7缺失时下调（GEO数据库：GSE17204）。（F、G）帕金森病（PD）患者与健康对照（HC）脑组织的RNA测序（GEO数据库：GSE114918）显示，CX3CL1在黑质致密部（SNc）高表达。（H）血清DJ-1和CX3CL1水平变化：早期PD（H-Y分期1-2）升高，晚期PD（H-Y分期3-5）降低。CX3CL1数据：HC组n=60，早期PD组n=84，晚期PD组n=76；DJ-1数据：HC组n=98，早期PD组n=23，晚期PD组n=29。（I）PD各阶段血清DJ-1与CX3CL1水平呈正相关：DJ-1组n=160，早期PD组n=84，晚期PD组n=76。数据以均值±标准误表示；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001（单因素方差分析，Tukey事后检验）。
DJ-1 通过 CX3CL1 的释放调节小胶质细胞的激活和促炎反应。(A, B)对野生型（WT）和 Park7 基因敲除（KO）小鼠的黑质（SN）中 CD11b 阳性反应的小胶质细胞进行流式细胞术分析，分析包括使用 MPTP 诱导和 CX3CL1 治疗的情况。(C, D) 对与 SH-SY5Y 神经元共培养的 BV2 小胶质细胞进行流式细胞术分析，检测 M1 标志物 CD86 和 M2 标志物 CD206 的表达，分析包括 Park7 基因敲低（KD）和 CX3CL1 治疗的情况。 (E–G) 通过 qPCR 分析 WT 和 Park7 KO 小鼠黑质组织裂解液中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平，分析包括 MPTP 诱导和 CX3CL1 治疗的情况。 (H–J) 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 WT 和 Park7 KO 小鼠黑质组织裂解液中细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的水平，分析包括 MPTP 诱导和 CX3CL1 治疗的情况。数据以均值 ± 标准误差（SEM）表示（每组 n = 3）；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，采用单因素方差分析后 followed by Tukey’s post hoc test 进行分析。 CD11b：分化簇 11b；CD206：分化簇 206；CD86：分化簇 86；CX3CL1：C-X3-C 基序趋化因子配体 1；DJ-1：蛋白退糖基化酶 DJ-1；ELISA：酶联免疫吸附试验；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；Iba-1：离子化钙结合适配分子；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；KD：基因敲低；KO：基因敲除；MPTP：1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶；NC：阴性对照；Park7：帕金森病蛋白 7；SN：黑质；TH：酪氨酸羟化酶；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；WT：野生型。
结论：本研究结果强调了 DJ-1 在调节小胶质细胞极化和控制神经炎症反应中的关键作用，维持了帕金森病（PD）模型中神经元与小胶质细胞的通讯。研究发现，Park7 的缺失或敲低导致 CX3CL1 水平降低，进而增强了促炎细胞因子的释放。值得注意的是，CX3CL1 治疗被发现可以将小胶质细胞极化转向抗炎（M2）表型，同时抑制促炎（M1）状态，在 MPTP 诱导的 PD 模型中尤为明显。通过选择性敲低 ADAM10 和 ADAM17，我们进一步证实了 DJ-1 在神经元内质网中 ADAM10 成熟中的关键作用。这一发现确定了 ADAM10 是介导 CX3CL1 膜脱落的主要蛋白酶。总体而言，我们的结果表明 DJ-1 在调节 PD 模型中神经元的 CX3CL1 表达方面发挥重要作用，并突出了 ADAM10 在介导人类神经元中 CX3CL1 释放中的关键酶作用。我们的研究表明，DJ-1 在介导 CX3CL1/CX3CR1 信号传导以影响 PD 模型中的小胶质细胞激活和神经炎症反应方面具有新作用。先前的研究表明 ADAM10 参与 CX3CL1 从神经元中的切割。在 PD 模型中进行进一步的体内研究对于揭示神经元-小胶质细胞相互作用的复杂机制及其在驱动神经炎症中的作用至关重要。我们的发现突出了 CX3CL1 作为解决 PD 中神经炎症通路的潜在治疗靶点，强调了其临床意义。研究 CX3CL1 如何影响小胶质细胞行为可能会为开发旨在减缓疾病进展和改善 PD 患者预后的治疗方法开辟新的途径。