IF 6.245 | BioTNT助力生物医学研究：约束诱导运动疗法通过抑制缺血性脑皮层中中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的积聚从而缓解运动功能障碍
2023年4月，复旦大学附属华山医院在国际期刊《Neurobiology of Disease》上发表的，题为“Constraint-induced movement therapy alleviates motor impairment by inhibiting the accumulation of neutrophil extracellular traps in ischemic cortex”的论文。Congqin Li, Jian Hu同位第一作者，Yulong Bai为通讯作者。
背景：中风是一个主要的公共卫生问题，缺血性中风占所有中风的 80–85%。超过 70% 的中风幸存者患有运动功能或其他神经功能障碍。在各种康复方法中，约束诱导运动疗法（CIMT）被认为是一种有效的康复策略。CIMT 通过限制健侧肢体的活动并反复强化患侧肢体的使用，从而克服患侧肢体的废用状态，这一点已得到循证医学的充分证实。但其具体治疗机制尚不明确。通过整合转录组学和多种富集分析（包括基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA）），我们发现 CIMT 广泛抑制了免疫反应、中性粒细胞趋化性和趋化因子介导的信号通路，提示 CIMT 可能对缺血性小鼠脑实质中的中性粒细胞产生影响。近期研究发现，积累的粒细胞释放由 DNA 和蛋白质组成的网状结构即中性粒细胞外陷阱（NETs），主要通过破坏血脑屏障和促进血栓形成来破坏神经功能。然而，中性粒细胞及其释放的 NETs 在脑实质中的时间与空间分布及其对神经细胞的损害效应尚不明确。
研究信息：利用免疫荧光和流式细胞术，我们的分析揭示了 NETs 在原发运动皮层（M1）、纹状体（Str）、对角带垂直肢核（VDB）、对角带水平肢核（HDB）和中间隔核（MS）等多个区域的侵蚀作用，并且在脑实质中至少持续 14 天，而 CIMT 可减少 M1 中 NETs 和趋化因子 CCL2、CCL5 的含量。有趣的是，在通过药理学抑制PAD4（瓜氨酸化精氨酸脱亚胺酶 4）抑制 NET 形成后，CIMT 未能进一步减少神经功能缺陷。综上所述，这些结果表明 CIMT 可通过调节中性粒细胞的激活来缓解脑缺血诱导的运动功能障碍。这些数据有望为缺血性脑实质中 NETs 表达提供直接证据，并为 CIMT 保护缺血性脑损伤的潜在机制提供新的见解。
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cust-其他引物
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200ul*10um*2
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2.11. 定量实时 PCR
使用 TRIzol 试剂（204204，Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）从梗死皮层的 M1 区提取总 RNA，按照制造商的说明进行操作。将大约 2 μg 的总 RNA 使用 PrimeScript™ RT Master Mix（TaKaRa，日本）逆转录为 cDNA。使用 TB Green Kit（TB Green® Premix Ex Taq™，TaKaRa，日本）进行实时 PCR。引物序列由 BioTNT 生物技术公司（中国）提供，如下：CXCL5（正向：5′- CTGCCCCTTCCTCAGTCATAG −3′；反向：5′- GGATCCAGACAGACCTCCTTC -3′）；CCL2（正向：5′- GCATCCACGTGTTGGCTCA −3′；反向：5′- CTCCAGCCTACTCATTGGGATCA -3′）；CCL5（正向：5′- ACTCCCTGCTGCTTTGCCTAC -3′；反向：5′- GAGGTTCCTTCGAGTGACA −3′）；β-actin（正向：5′- AAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACC -3′；反向：5′-AGCCAGTCCAGACGCAGGAT −3′）。使用 2−ΔΔCT 方法计算相关 mRNA 的水平，并以 β-Actin mRNA 的水平进行标准化。
结果：
CIMT诱导的缺血后脑组织分子特征。（A）选定趋化因子活性相关基因的热图。（B-D）PCR分析显示，CXCL5、CCL2和CCL5的mRNA表达趋势与RNA测序结果一致。MCAO术后14天检测缺血脑组织中CXCL5、CCL2和CCL5的蛋白表达水平。ELISA法测定这些细胞因子水平（E-G）。数值以均值±标准误表示。*P < 0.05，**P < 0.01（单因素方差分析，Tukey多重比较检验）；ns表示无显著性差异。
结论：本研究主要揭示了小鼠脑缺血/灌注后神经元恢复过程中微环境的变化，特别是中性粒细胞及其释放的 NETs 的时空分布。有趣的是，尽管中性粒细胞迅速耗尽，但其释放的 NETs 长期存在于缺血脑实质中，包括原发运动皮层、纹状体和基底前脑，这可能是残留神经细胞功能恢复的关键障碍。本研究首次探讨了 CIMT 是否通过作用于 NETs 对残留神经元的功能恢复产生积极影响。结果表明，CIMT 对 NETs 清除及降低 CCL2 和 CCL5 等趋化因子具有积极作用。总体而言，我们的研究为 CIMT 治疗提供了新的机制见解。