IF 6.511 | BioTNT助力生物医学研究：维生素 D 通过下调 SLC7A11 促进结直肠癌干细胞的铁死亡
2023年2月，山东大学第二医院在国际期刊《Oxidative Medicine and Cellular Longevity》上发表的，题为“Vitamin D Promotes Ferroptosis in Colorectal Cancer Stem Cells via SLC7A11 Downregulation”的论文。Shuang Guo为第一作者，Lan Liu为通讯作者。
背景：结直肠癌（CRC）是一种发病率和死亡率均较高的常见恶性肿瘤。手术是 CRC 的基本治疗方法，而辅助化疗通常用于改善患者预后。最近研究表明，结直肠癌干细胞（CCSCs）在结直肠癌（CRC）的预后、化疗耐药性和治疗失败中发挥重要作用。因此，靶向 CCSCs 可能提高 CRC 的治疗效果。一些数据表明，铁死亡诱导剂可特异性靶向肿瘤中的癌症干细胞（CSCs）。维生素 D（VD）在癌症治疗中具有潜在应用价值。研究表明，VD 和VD 受体 (VDR) 影响 CCSCs 的干性，肿瘤微环境的酸性会导致 VDR 表达减少，并通过调节 SOX2 表达影响 CRC 细胞的干性。然而，关于 VD 与 CCSCs 铁死亡关系的信息尚不明确。因此，本研究旨在确定 VD 与 CCSCs 铁死亡的相关性，并探讨 VD 处理的 CCSCs 铁死亡下游分子机制，包括体外和体内研究。
研究信息：本研究旨在探讨 VD 对 CCSCs 铁死亡的影响。为此，我们用不同浓度的 VD 处理 CCSCs，并进行肿瘤球形成实验、透射电子显微镜观察以及测定半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）水平。此外，通过体外和体内功能实验、西方印迹和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR），探讨 VD 的下游分子机制。结果显示，VD 处理显著抑制了 CCSCs 的增殖，并减少了体外肿瘤球的数量。进一步评估表明，与对照组相比，VD 处理的 CCSCs 显示出显著更高的 ROS 水平以及更低的 Cys 和 GSH 水平，线粒体膜增厚，线粒体变窄甚至破裂。这些结果表明，VD 处理显著诱导了 CCSCs 的铁死亡。进一步研究发现，SLC7A11 过表达显著减弱了 VD 诱导的 CCSCs 铁死亡。因此，我们得出结论，VD 通过下调 SLC7A11 体外和体内诱导 CCSCs 铁死亡。这些结果为 VD 治疗 CRC 提供了新的证据，并为 VD 诱导 CCSCs 铁死亡提供了新的见解。
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GR0208
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5*1ml
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2.7 蛋白质免疫印迹（Western Blotting）
细胞裂解采用Sigma-Aldrich公司提供的细胞裂解液，加入BioTNT（中国上海）的Loading Buffer后，95℃加热15分钟使蛋白质变性。大约20μg的总蛋白通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，德国达姆施塔特）。膜与一抗和二抗孵育后，使用ECL化学发光试剂（Pierce，美国伊利诺伊州伊塔斯卡）进行检测。所用一抗如下：SRY盒转录因子2（SOX2）（2748S，1:1000，Cell Signaling，美国马萨诸塞州波士顿）、有机阳离子/肉碱转运蛋白4（OCT4）（2750S，1:1000，Cell Signaling）、Nanog同源盒蛋白（Nanog）（3580S，1:1000，Cell Signaling）、SLC7A11（26864-1-AP/R，1:1000，Proteintech，中国武汉）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）（14432-1-AP/R，1:1000，Proteintech）、细胞色素c氧化酶亚基II（COX2）（66351-1-Ig/M，1:1000，Proteintech）和β-actin（TA-09/M，1:5000，ZSGB-BIO，中国北京）。使用ImageJ软件分析蛋白表达的灰度值，并将相对蛋白表达水平标准化至β-actin的表达水平。
结果：
结直肠癌干细胞（CCSCs）的表型鉴定。（a）悬浮干细胞表型。横纵轴标签分别为Count和FITC-A，#1为门标签，无四分位标签。（b、c）CCSCs中干性标志物（SOX2、OCT4和Nanog）的蛋白质免疫印迹及定量分析。（d）CCSCs中干性标志物（SOX2、OCT4和Nanog）的qRT-PCR分析。数据以均值±标准差表示；**P < 0.01。
维生素D诱导CCSCs铁死亡。（a）流式细胞术检测不同浓度VD处理的CCSCs中ROS水平。结果以百分比表示；柱状图汇总定量数据，代表三次独立实验的均值±标准差。（b）不同浓度VD处理的CCSCs中Cys水平。（c）不同浓度VD处理的CCSCs中GSH水平。（d）透射电镜观察不同浓度VD处理的CCSCs。下方图像为红色区域放大图。红色箭头指示线粒体膜增厚及线粒体缩小，黄色箭头指示线粒体嵴，蓝色箭头指示破裂线粒体。上图比例尺：5μm；下图比例尺：1μm。（e、f）不同浓度VD处理的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。（g）不同浓度VD处理的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的qRT-PCR分析。数据以均值±标准差表示；*P < 0.05，**P < 0.01。
SLC7A11过表达增强CCSCs增殖并抑制其铁死亡。（a）CCK-8法检测转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs增殖能力。（b）转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中Cys水平。（c）转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中GSH水平。（d）流式细胞术检测转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs内ROS水平。结果以百分比表示；柱状图汇总三次独立实验的定量数据（均值±标准差）。（e、f）转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。（g）转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的qRT-PCR分析。（h）透射电镜观察转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs。下方图像为红色区域放大图。红色箭头指示线粒体膜增厚及线粒体缩小，黄色箭头指示线粒体嵴。上图比例尺：5μm；下图比例尺：1μm。数据以均值±标准差表示；*P < 0.05，**P < 0.01。
SLC7A11过表达挽救VD诱导的CCSCs体外铁死亡。（a）不同组别CCSCs的肿瘤球体形成。比例尺：100μm。（b）不同组别CCSCs的肿瘤球体数量。（c）CCK-8法检测不同组别CCSCs的增殖能力。（d）不同组别CCSCs中Cys水平。（e）不同组别CCSCs中GSH水平。（f）流式细胞术检测不同组别CCSCs内ROS水平。结果以百分比表示；柱状图汇总三次独立实验的定量数据（均值±标准差）。（g、h）不同组别CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。（i）不同组别CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的qRT-PCR分析。数据以均值±标准差表示；*P < 0.05，**P < 0.01。
SLC7A11过表达挽救VD诱导的CCSCs体内铁死亡。（a）荷瘤裸鼠的典型照片。（b）切除肿瘤的典型照片。（c）实验期间小鼠肿瘤体积的变化。（d）五周后不同组别小鼠切除肿瘤的重量。（e）裸鼠切除肿瘤中Cys水平。（f）裸鼠切除肿瘤中GSH水平。（g）流式细胞术检测裸鼠切除肿瘤中ROS的细胞水平。结果以百分比表示；柱状图汇总三次独立实验的定量数据（均值±标准差）。（h、i）不同组别裸鼠切除肿瘤中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。数据以均值±标准差表示；*P < 0.05，**P < 0.01。
结论：本研究发现了维生素 D（VD）对结直肠癌干细胞（CCSCs）铁死亡的体内外作用，揭示了 VD 通过下调 SLC7A11 诱导铁死亡的机制。我们的结果为 VD 在结直肠癌（CRC）治疗中的应用提供了新的治疗参考，并为其对铁死亡的影响提供了新的见解。