IF 6.511 | BioTNT助力生物医学研究:维生素 D 通过下调 SLC7A11 促进结直肠癌干细胞的铁死亡
2023年2月,山东大学第二医院在国际期刊《Oxidative Medicine and Cellular Longevity》上发表的,题为“Vitamin D Promotes Ferroptosis in Colorectal Cancer Stem Cells via SLC7A11 Downregulation”的论文。Shuang Guo为第一作者,Lan Liu为通讯作者。
背景:结直肠癌(CRC)是一种发病率和死亡率均较高的常见恶性肿瘤。手术是 CRC 的基本治疗方法,而辅助化疗通常用于改善患者预后。最近研究表明,结直肠癌干细胞(CCSCs)在结直肠癌(CRC)的预后、化疗耐药性和治疗失败中发挥重要作用。因此,靶向 CCSCs 可能提高 CRC 的治疗效果。一些数据表明,铁死亡诱导剂可特异性靶向肿瘤中的癌症干细胞(CSCs)。维生素 D(VD)在癌症治疗中具有潜在应用价值。研究表明,VD 和VD 受体 (VDR) 影响 CCSCs 的干性,肿瘤微环境的酸性会导致 VDR 表达减少,并通过调节 SOX2 表达影响 CRC 细胞的干性。然而,关于 VD 与 CCSCs 铁死亡关系的信息尚不明确。因此,本研究旨在确定 VD 与 CCSCs 铁死亡的相关性,并探讨 VD 处理的 CCSCs 铁死亡下游分子机制,包括体外和体内研究。
研究信息:本研究旨在探讨 VD 对 CCSCs 铁死亡的影响。为此,我们用不同浓度的 VD 处理 CCSCs,并进行肿瘤球形成实验、透射电子显微镜观察以及测定半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平。此外,通过体外和体内功能实验、西方印迹和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR),探讨 VD 的下游分子机制。结果显示,VD 处理显著抑制了 CCSCs 的增殖,并减少了体外肿瘤球的数量。进一步评估表明,与对照组相比,VD 处理的 CCSCs 显示出显著更高的 ROS 水平以及更低的 Cys 和 GSH 水平,线粒体膜增厚,线粒体变窄甚至破裂。这些结果表明,VD 处理显著诱导了 CCSCs 的铁死亡。进一步研究发现,SLC7A11 过表达显著减弱了 VD 诱导的 CCSCs 铁死亡。因此,我们得出结论,VD 通过下调 SLC7A11 体外和体内诱导 CCSCs 铁死亡。这些结果为 VD 治疗 CRC 提供了新的证据,并为 VD 诱导 CCSCs 铁死亡提供了新的见解。
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5*1ml
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2.7 蛋白质免疫印迹(Western Blotting)
细胞裂解采用Sigma-Aldrich公司提供的细胞裂解液,加入BioTNT(中国上海)的Loading Buffer后,95℃加热15分钟使蛋白质变性。大约20μg的总蛋白通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore,德国达姆施塔特)。膜与一抗和二抗孵育后,使用ECL化学发光试剂(Pierce,美国伊利诺伊州伊塔斯卡)进行检测。所用一抗如下:SRY盒转录因子2(SOX2)(2748S,1:1000,Cell Signaling,美国马萨诸塞州波士顿)、有机阳离子/肉碱转运蛋白4(OCT4)(2750S,1:1000,Cell Signaling)、Nanog同源盒蛋白(Nanog)(3580S,1:1000,Cell Signaling)、SLC7A11(26864-1-AP/R,1:1000,Proteintech,中国武汉)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)(14432-1-AP/R,1:1000,Proteintech)、细胞色素c氧化酶亚基II(COX2)(66351-1-Ig/M,1:1000,Proteintech)和β-actin(TA-09/M,1:5000,ZSGB-BIO,中国北京)。使用ImageJ软件分析蛋白表达的灰度值,并将相对蛋白表达水平标准化至β-actin的表达水平。
结果:
结直肠癌干细胞(CCSCs)的表型鉴定。(a)悬浮干细胞表型。横纵轴标签分别为Count和FITC-A,#1为门标签,无四分位标签。(b、c)CCSCs中干性标志物(SOX2、OCT4和Nanog)的蛋白质免疫印迹及定量分析。(d)CCSCs中干性标志物(SOX2、OCT4和Nanog)的qRT-PCR分析。数据以均值±标准差表示;**P < 0.01。
维生素D诱导CCSCs铁死亡。(a)流式细胞术检测不同浓度VD处理的CCSCs中ROS水平。结果以百分比表示;柱状图汇总定量数据,代表三次独立实验的均值±标准差。(b)不同浓度VD处理的CCSCs中Cys水平。(c)不同浓度VD处理的CCSCs中GSH水平。(d)透射电镜观察不同浓度VD处理的CCSCs。下方图像为红色区域放大图。红色箭头指示线粒体膜增厚及线粒体缩小,黄色箭头指示线粒体嵴,蓝色箭头指示破裂线粒体。上图比例尺:5μm;下图比例尺:1μm。(e、f)不同浓度VD处理的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。(g)不同浓度VD处理的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的qRT-PCR分析。数据以均值±标准差表示;*P < 0.05,**P < 0.01。
SLC7A11过表达增强CCSCs增殖并抑制其铁死亡。(a)CCK-8法检测转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs增殖能力。(b)转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中Cys水平。(c)转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中GSH水平。(d)流式细胞术检测转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs内ROS水平。结果以百分比表示;柱状图汇总三次独立实验的定量数据(均值±标准差)。(e、f)转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。(g)转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的qRT-PCR分析。(h)透射电镜观察转染sh-SLC7A11或OE-SLC7A11的CCSCs。下方图像为红色区域放大图。红色箭头指示线粒体膜增厚及线粒体缩小,黄色箭头指示线粒体嵴。上图比例尺:5μm;下图比例尺:1μm。数据以均值±标准差表示;*P < 0.05,**P < 0.01。
SLC7A11过表达挽救VD诱导的CCSCs体外铁死亡。(a)不同组别CCSCs的肿瘤球体形成。比例尺:100μm。(b)不同组别CCSCs的肿瘤球体数量。(c)CCK-8法检测不同组别CCSCs的增殖能力。(d)不同组别CCSCs中Cys水平。(e)不同组别CCSCs中GSH水平。(f)流式细胞术检测不同组别CCSCs内ROS水平。结果以百分比表示;柱状图汇总三次独立实验的定量数据(均值±标准差)。(g、h)不同组别CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。(i)不同组别CCSCs中GPX4、SLC7A11和COX2的qRT-PCR分析。数据以均值±标准差表示;*P < 0.05,**P < 0.01。
SLC7A11过表达挽救VD诱导的CCSCs体内铁死亡。(a)荷瘤裸鼠的典型照片。(b)切除肿瘤的典型照片。(c)实验期间小鼠肿瘤体积的变化。(d)五周后不同组别小鼠切除肿瘤的重量。(e)裸鼠切除肿瘤中Cys水平。(f)裸鼠切除肿瘤中GSH水平。(g)流式细胞术检测裸鼠切除肿瘤中ROS的细胞水平。结果以百分比表示;柱状图汇总三次独立实验的定量数据(均值±标准差)。(h、i)不同组别裸鼠切除肿瘤中GPX4、SLC7A11和COX2的蛋白质免疫印迹及定量分析。数据以均值±标准差表示;*P < 0.05,**P < 0.01。
结论:本研究发现了维生素 D(VD)对结直肠癌干细胞(CCSCs)铁死亡的体内外作用,揭示了 VD 通过下调 SLC7A11 诱导铁死亡的机制。我们的结果为 VD 在结直肠癌(CRC)治疗中的应用提供了新的治疗参考,并为其对铁死亡的影响提供了新的见解。