IF 6.831 | BioTNT助力生物医学研究：多巴胺 D1 受体激动剂通过调节巨噬细胞中的炎症反应以及气道上皮细胞中的屏障功能来减轻急性肺损伤
2023年6月，山东中医药大学在国际期刊《Free Radical Biology and Medicine》上发表的，题为“Dopamine D1 receptor agonist alleviates acute lung injury via modulating inflammatory responses in macrophages and barrier function in airway epithelial cells”的论文。Linlin Meng, Muyun Wang, Yixuan Gao同位第一作者，Wei Gao,Qinghua Liu为通讯作者。
背景：急性肺损伤（ALI）或急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是常见的危重疾病，其特征是进行性肺部炎症、肺水肿和弥漫性肺泡损伤，常导致危及生命的低氧性呼吸衰竭。尽管在 ALI/ARDS 的管理上取得了巨大进展，但每年仍有约 300 万名患者，死亡率超过 40%，这可能归因于缺乏有效的治疗药物。因此，开发治疗 ALI/ARDS 的药物对于降低死亡率和改善预后至关重要。大量证据表明，过度的炎症反应和上皮屏障功能受损是 ALI/ARDS 发病机制的关键因素。最近研究发现，多巴胺（DA）系统参与了多种肺部疾病。
研究信息：本研究中，我们首次发现多巴胺 D1 类受体（D1 和 D5）主要表达于巨噬细胞和气道上皮细胞（AECs），且在脂多糖（LPS）诱导的 ALI 小鼠肺组织中表达下调。SKF38393（SKF）是一种 D1 类受体的选择性激动剂，已被证明能抑制 THP-1 细胞衍生的巨噬细胞和 Beas-2B 细胞中过度的炎症反应和氧化应激，并改善 LPS 刺激引起的气道上皮屏障功能障碍。此外，SKF 给药可有效减少 LPS 诱导的 ALI 小鼠模型中的肺部炎症，减轻组织损伤。使用特定抑制剂 ML385 进行研究表明，SKF 的广泛保护作用可能归因于其通过激活 Nrf2 抗氧化系统实现。本研究为 SKF 在巨噬细胞、AECs 以及 ALI 小鼠模型中的强大免疫调节活性提供了证据，为干预 ALI/ARDS 开辟了新的治疗途径。
使用产品：
|
产品货号
|
产品名称
|
产品规格
|
|
cust-其他引物
|
|
200ul*10um*2
|
2.3. 细胞因子检测
采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测 THP-1 细胞衍生的巨噬细胞和 Beas-2B 细胞中的细胞因子水平。ELISA 检测时，将细胞接种于 96 孔板，用脂多糖（LPS）单独或与 SKF38393/ML385 联合处理 24 小时，收集上清液，按照制造商说明书（Multi Sciences Biotech，中国）使用 ELISA 试剂盒定量检测小鼠白细胞介素 -6（IL-6）、角质形成细胞趋化因子（KC）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）以及人 chemokine（C-C 结构域）配体 2（CCL2）、IL-6、IL-1β 等细胞因子。
qPCR 检测时，将 THP-1 细胞衍生的巨噬细胞和 Beas-2B 细胞接种于 12 孔板。不同处理后，采用 TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）提取细胞总 RNA，PrimeScript RT Master Mix Kit（TaKaRa，日本）反转录 RNA，使用 SYBR Green qPCR Mix（Takara，日本）和 Applied Biosystems 7500 系统进行 qPCR。以 GAPDH 为内参基因，采用 2−ΔΔCt 法计算细胞因子 mRNA 水平。特异性引物购自 BioTNT（中国），序列如下：
人 IL-6 正向引物：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG，
反向引物：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG；
人 IL-1β 正向引物：GAAATGCCACCTTTTGACAGTG，
反向引物：TGGATGCTCTCATCAGGACAG；
人 CCL2 正向引物：TTCTGTGCCTGCTGCTCAT，
反向引物：GGGGCATTGATTGCATCT；
人 IL-17A 正向引物：TGTCACTGCTACTGCTGCT，
反向引物：GGTTATGGATGTTCAGGTTG；
人 IL-8 正向引物：GAGCCAGGAAGAAACCACCG，
反向引物：TGGCAAAACTGCACCTTCACA；
人 GAPDH 正向引物：GGACTCATGACCACAGTCCA，
反向引物：TCAGCTCAGGGATGACCTTG。
结果：
SKF 在 LPS 刺激的 THP-1 细胞衍生巨噬细胞中的抗炎和抗氧化活性（A）SKF 的化学结构式。（B）使用不同浓度的 SKF（0.1–50 μM）处理的 THP-1 细胞衍生巨噬细胞的活力，处理条件为有或无 LPS（100 ng/mL）刺激。（C、D）SKF 对 LPS 诱导的 THP-1 细胞衍生巨噬细胞中细胞因子 CCL2、IL-6 和 IL-1β 的分泌（C）和 mRNA 表达（D）的影响。（E、F）共聚焦显微镜及其定量分析显示 SKF 对 LPS 诱导的线粒体活性氧（ROS）生成的影响。（G）微孔板读数分析显示 SKF 对 LPS 诱导的线粒体 ROS 生成的影响。标尺 = 100 微米。n = 4。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns：无显著性。误差线表示平均值 ± 标准误差（SEM）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），后接 Bonferroni 事后检验。
SKF 对 LPS 诱导的 Beas-2B 细胞气道上皮屏障功能障碍的保护作用（A）用不同浓度的 SKF（0.1–50 μM）处理的 Beas-2B 细胞的活力，处理条件为有或无 LPS（100 ng/mL）刺激。（B）SKF 对 LPS 刺激的 Beas-2B 细胞中细胞因子 CCL2、IL-6、IL-1β、IL-17A 和 IL-8 的 mRNA 表达的影响。（C）微孔板读数分析显示 SKF 对 LPS 诱导的线粒体活性氧（ROS）生成的抑制作用。n = 4。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns：无显著性。（D）SKF 预处理提高了 Beas-2B 细胞单层的跨上皮电阻（TEER）比值，以应对 LPS 挑战。n = 4。##p < 0.01，####p < 0.0001，对照组与 LPS 组比较；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，LPS 组与 LPS + SKF 50 μM 组比较。（E–G）Western blot 分析显示 SKF 对以下方面的调控作用：（E）ZO-1 和 Occludin 的表达，以维持上皮屏障的完整性；（F）p-65 的磷酸化，以激活 NF-κB 信号通路；p38 和 Erk1/2 的磷酸化，以激活 MAPK 信号通路；（G）Nrf2 和 NQO1 的表达，以增强抗氧化系统。与 LPS 组比较，*p < 0.05，***p < 0.001。n = 3–4。误差线表示平均值 ± 标准误差（SEM）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），后接 Bonferroni 事后检验。
Nrf2 抑制剂 ML 消除了 SKF 在 LPS 刺激的 THP-1 细胞衍生巨噬细胞中的保护作用。（A）ML 的化学结构式。（B）ML（1 μM–10 μM）对 THP-1 细胞衍生巨噬细胞活力的影响，测试条件为与 100 ng/mL LPS 联合使用。（C）ML（5 μM）预处理逆转了 SKF（50 μM）对 LPS 刺激的 THP-1 细胞衍生巨噬细胞中细胞因子 CCL2、IL-6、IL-1β 的 mRNA 表达的抑制作用。（D、E）微孔板读数分析（D）和共聚焦显微镜（E）显示 ML 对 SKF 减少的线粒体 ROS 生成的影响。标尺 = 50 μm。n = 4。*p < 0.05，***p < 0.001，ns：无显著性。（F）免疫印迹和定量分析证实了 ML 对 SKF 在 LPS 暴露的 THP-1 细胞衍生巨噬细胞中抑制的 NLRP3/Caspase-1 通路激活的影响。n = 3。**p < 0.01，***p < 0.001，LPS 组与 LPS + SKF 组比较；#p < 0.05，LPS + SKF 组与 LPS + SKF + ML 组比较。误差线表示平均值 ± 标准误差（SEM）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），后接 Bonferroni 事后检验。
Nrf2 抑制剂 ML 消除了 SKF 对 LPS 刺激下 Beas-2B 细胞气道上皮屏障功能障碍的调节作用。（A）在 LPS（100 ng/mL）刺激下，用 ML（1 μM–10 μM）孵育的 Beas-2B 细胞的活力。（B）ML（5 μM）预处理消除了 SKF（50 μM）对 LPS 刺激的 Beas-2B 细胞中细胞因子 CCL2、IL-6、IL-1β、IL-17A 和 IL-8 的 mRNA 表达的抑制作用。（C、D）微孔板读数分析（C）和共聚焦显微镜（D）显示 ML 对 SKF 减少的 Beas-2B 细胞线粒体 ROS 生成的影响。标尺 = 50 μm。n = 4。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns：无显著性。（E）免疫印迹和定量分析确定了 ML 对 SKF 在 LPS 暴露的 Beas-2B 细胞中减少的 p65/NF-κB 磷酸化和增加的 NQO1 表达的影响。n = 3。**p < 0.01，****p < 0.0001，LPS 组与 LPS + SKF 组比较；#p < 0.05，##p < 0.01，LPS + SKF 组与 LPS + SKF + ML 组比较。（F）ML 消除了 SKF 对 AEC 单层 TEER 的增强作用。n = 3。&p < 0.05，&&&p < 0.001，&&&&p < 0.0001，对照组与 LPS 组比较；#p < 0.05，###p < 0.001，LPS 组与 LPS + SKF 组比较；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，LPS + SKF 组与 LPS + SKF + ML 组比较。误差线表示平均值 ± 标准误差（SEM）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），后接 Bonferroni 事后检验。
结论：本研究首次揭示了多巴胺D1样受体激动剂SKF通过激活Nrf2通路，调控巨噬细胞和AECs的炎症及氧化应激反应，并在ALI小鼠模型中展现出显著的肺保护作用。这为ALI/ARDS的治疗提供了新的潜在靶点。然而，SKF的其他潜在机制（如代谢重编程、线粒体功能调控等）仍需进一步探索。未来研究可结合临床前模型验证其安全性和有效性，推动其向临床转化。