IF 9.35| BioTNT助力生物研究：肌肉PARP1抑制通过AMPKα的PAR化修饰与激活延长果蝇寿命
2022年8月，复旦大学在国际期刊《PNAS》上发表的，题为“Muscle PARP1 inhibition extends lifespan through AMPKα PARylation and activation in Drosophila”的论文。Shanshan Guo, Shuang Zhang,Yixiao Zhuang, Famin Xie同位第一作者，Xingxing Kong,Tiemin Liu为通讯作者。
背景：衰老是一个复杂的进程，不能简单地用单一途径或一组密切相关途径来解释。线粒体作为细胞的主要能量中心，在细胞生理中发挥着关键作用。线粒体的更新需要清除功能失调的线粒体并生成新的健康线粒体。然而，目前尚不清楚这些功能在衰老过程中如何受到影响，以及不同的抗衰老干预措施是否需要不同的线粒体网络。一些研究表明，抑制线粒体分裂和维持融合与延寿有关，但线粒体自噬需要分裂来清除受损线粒体，并已在果蝇中被证明具有延寿效应。因此，特定线粒体状态与延寿或促衰之间的关系在不同的情境和细胞类型中仍不明确。
研究信息：在此，我们展示了敲低PARP1可延长果蝇的寿命，尤其强调了骨骼肌在这方面的作用。这种肌肉特异性突变果蝇表现出对饥饿和氧化应激的抵抗性，以及随着年龄增长攀爬能力的增强，同时线粒体生物生成和活性也得到提升。从机制上讲，抑制PARP1能够增加 AMP 激活的蛋白激酶 alpha（AMPKα）的活性和线粒体的更新。PARP1 可以与 AMPKα相互作用，然后通过在 E155 和 E195 位点的多（ADP 核糖）基化（PAR 化）来调控 AMPKα。在果蝇的肌肉中特异性地同时敲低 PARP1 和 AMPKα能够抵消 PARP1 抑制的效果。最后，我们展示通过维持线粒体网络稳态来延长寿命需要完整的 PTEN 诱导激酶 1（PINK1）。综上所述，这些数据表明 PARP1 和 AMPKα之间的相互作用可以调节线粒体的更新，可作为促进长寿的靶点。
使用产品：
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801-104-1
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1 mL
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801-105-1
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共免疫沉淀
对于共免疫沉淀实验，样品取自经奥拉帕尼处理的果蝇 S2 细胞以及转染了 pActin-Gal4、PARP1-FLAG 和 AMPKα-GFP 或 pActin-Gal4、PARP1-FLAG、AMPKα domain1-GFP 或 pActin-Gal4、PARP1-FLAG、AMPKα domain2-GFP 或 pActin-Gal4、PARP1-FLAG 和 AMPKα domain3-GFP 的果蝇 S2 细胞，转染时间为 48 小时。对于内源性免疫沉淀，样品取自果蝇的间接飞行肌。使用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的 RIPA 缓冲液收集蛋白，并在 4 °C 下与抗 FLAG/GFP 抗体孵育过夜。随后，将蛋白固定于 Protein A/G 磁珠 CH210501（BioTNT），并通过 Western blot 分析。
结果：
敲低果蝇肌肉中的PARP1可延长寿命，并在晚年增强线粒体生物生成和自噬。（A）通过分析 mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇的间接飞行肌中的 Parp1 表达（n≥4，每组生物重复15只果蝇，****P < 0.0001）。（B）检测 mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇间接飞行肌中 PARP1 和 PAR 化蛋白水平（n=3，每组生物重复20只果蝇）。（C）mef2-Gal4ts> Luc RNAi（n=221）和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi（n=257）雌性果蝇的存活曲线（****P < 0.0001）。（D）mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 雌性果蝇的摄食行为实验（CAFE）（n=10，每组生物重复4只果蝇）。（E）mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 雌性果蝇的体重（n=10，每组生物重复8只果蝇）。（F）mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 雌性果蝇的攀爬指数（n=10，每组生物重复20只果蝇，***P < 0.001）。（G）在饥饿胁迫下，mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 雌性果蝇的存活率（n>80，****P < 0.0001）。（H）在氧化胁迫条件下，mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 雌性果蝇的存活率（n≥80，****P < 0.0001）。（I）对 mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇的间接飞行肌进行免疫染色并定量分析，显示线粒体（绿色，TOM20）和肌肉（红色，肌动蛋白）（比例尺，10 μm [n=3，****P < 0.0001]）。（J）检测 mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇间接飞行肌中的线粒体 DNA（mtDNA）数量（n=3，*P < 0.05）。（K–M）检测 mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇间接飞行肌中 PGC-1α、P62、LC3 和 PINK1 的蛋白表达（n=3）。（N）mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇间接飞行肌的电子显微照片（比例尺，500 nm）。（O）经奥拉帕尼处理的果蝇 S2 细胞中 LC3 与线粒体的共定位（比例尺，10 μm）。（P）通过 O2K 测定果蝇间接飞行肌的氧化磷酸化（OXPHOS）能力（n=3，每组生物重复3只果蝇，*P < 0.05）。（Q）对 mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇的间接飞行肌进行染色并定量分析，显示泛素化（绿色，抗泛素）和肌肉（红色，肌动蛋白）（比例尺，10 μm [n=3，*P < 0.05]）。（R）Western blot 分析果蝇间接飞行肌中总泛素结合蛋白（n=3）。所有数据均以均值±标准误差（mean±SEM）表示。
PARP1 与 AMPKα 相互作用，并通过转录后修饰调节其活性。（A）分析 tub-Gal4ts> Luc RNAi 和 tub-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇中 SIRT1 的蛋白表达（n=2）。（B）通过免疫沉淀检测 tub-Gal4ts> Luc RNAi 和 tub-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇中 dFOXO 的乙酰化水平（n=1）。（C 和 D）检测 tub-Gal4ts> Luc RNAi 和 tub-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇间接飞行肌以及经 60 μM 奥拉帕尼处理的果蝇 S2 细胞中 AMPKα 的磷酸化水平（n=2 至 3）。（E 和 F）通过免疫沉淀检测 mef2-Gal4ts> Luc RNAi 和 mef2-Gal4ts> Parp1 RNAi 果蝇间接飞行肌或经 60 μM 奥拉帕尼处理的果蝇 S2 细胞中 AMPKα 的 PAR 化水平。（G）通过质谱分析鉴定 AMPKα 相互作用蛋白。（H）在果蝇间接飞行肌中内源性共免疫沉淀 PARP1 和 AMPKα。（I）AMPKα domain1-3-GFP 质粒的结构及在果蝇 S2 细胞中共免疫沉淀 PARP1 和 AMPKα domain 1 至 3。（J）检测 AMPKα-GFP 融合蛋白及其突变体的 PAR 化水平。（K）不同物种中 AMPKα 的假定 PAR 化位点保守性。（L）AMPKαE155+195G、AMPKαE155G、AMPKαE195G 的 PAR 化检测。所有数据均以均值±标准误差（mean±SEM）表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
结论：我们发现 PARP1 活性降低与老年飞行肌中蛋白质稳态丧失和线粒体功能障碍相关。抑制 PARP1 增加线粒体生物生成，提升线粒体氧化磷酸化能力和减少线粒体 ROS，恢复老年果蝇蛋白质稳态。研究还表明 PARP1 抑制诱导 DRP1 介导的长寿。PARP1 敲低可改善老年哺乳动物中下降的线粒体自噬。我们发现 PARP1 抑制通过 AMPKα调节 PGC-1α和 PINK1，影响线粒体生物生成和质量控制。这些发现为理解线粒体功能与衰老关系提供了新视角。临床中 PARP 抑制剂作为抗肿瘤药物使用，本研究提示其作为抗衰老剂潜力，但需谨慎。PARP1 是基因组维护的关键因子，PARP1 敲除小鼠可能加剧 DNA 损伤，因此评估 PARP1 抑制的治疗潜力和局限性时，考虑衰老对 DNA 损伤的影响至关重要。本研究存在局限性，但为未来抗衰老治疗提供了新靶点和机制理解。