Crystal Chem—超灵敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒
货号90060
A. 预期用途
超灵敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒用于定量测定大鼠血清、血浆和体液中的胰岛素。进行本检测前，请务必阅读完整的试剂盒说明书。本试剂盒仅供研究使用，不可用于临床或诊断程序，也不可用于人类或动物的体内或体外应用。
B. 引言
胰岛素是胰岛β细胞分泌的主要激素，不仅已知可调节葡萄糖代谢（即血液葡萄糖向肝脏和外周组织的摄取），还参与其他重要的生理功能。近年来，糖尿病和肥胖症发病率的上升，推动了对胰岛素水平及其分泌机制的深入研究。因此，准确测量实验动物体内的胰岛素浓度变得愈发重要。
本试剂盒采用简单、精准且高灵敏度的ELISA双抗体夹心法检测大鼠胰岛素，可实现以下检测范围：
表1. 检测灵敏度范围（基于5 µL样本）
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检测类型
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灵敏度范围
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低范围检测（I部分）
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0.1-6.4 ng/mL
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宽范围检测（J部分）
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0.1-12.8 ng/mL
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高范围检测（K部分）
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1-64 ng/mL
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使用100 µL样本时，灵敏度可高达5 pg/mL；适用于筛选目的。
C. 检测原理
1. 第一反应：样本中的大鼠胰岛素与包被在微孔板孔内的豚鼠抗胰岛素抗体结合。
2. 洗涤：去除未结合的物质。
3. 第二反应：辣根过氧化物酶（POD）标记的抗胰岛素抗体与固定在微孔板上的“抗体-胰岛素”复合物结合。
4. 洗涤：去除多余的酶结合物。
5. 酶反应：加入3,3,5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，与结合的POD酶发生显色反应。
6. 吸光度测量：在特定波长下测量吸光度。
7. 结果计算：通过绘制标准曲线（吸光度 vs. 胰岛素标准品浓度），插值计算样本中的胰岛素浓度。
D. 试剂盒储存
1. 收到试剂盒后，于2-8°C避光储存，切勿冷冻或置于25°C以上环境。
2. 试剂盒过期后禁止使用。
E. 检测材料
E.1. 试剂盒包含材料
表2. 试剂盒内容
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标记
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名称
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规格
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A
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抗体包被微孔板（6×8孔模块/包）
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2包（共96孔）
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B
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大鼠胰岛素冻干标准品
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2.56 ng/瓶（100 µL用）
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C
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抗胰岛素酶结合物储备液
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1瓶（8 mL）
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D
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酶结合物稀释液
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1瓶（4 mL）
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E
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酶底物（TMB）溶液
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1瓶（13 mL）
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F
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酶反应终止液（1N硫酸）
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1瓶（13 mL）
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G
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样本稀释液
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1瓶（30 mL）
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H
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洗涤缓冲液储备液（20×浓缩）
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1瓶（50 mL）
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-
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微孔板固定框架
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1个
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-
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塑料微孔板盖
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1个
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E.2. 需自备材料
- 微量移液器（1-10 µL、10-100 µL、100-1000 µL）及一次性吸头
- 容量瓶（1 L）
- 蒸馏水或去离子水
- 聚丙烯微管
- 试管架
- 涡旋混合器
- 洗板机或抽吸器
- 微孔板读数仪（可检测450 nm和630 nm吸光度）
F. 试剂注意事项
1. 避免直接接触酶底物溶液（E）和终止液（F），若接触皮肤或眼睛，立即用大量清水冲洗并就医。
2. 酶底物溶液（E）不得接触金属，以防污染。
3. 仅限经过培训的人员操作，实验时需穿戴防护装备（如手套、白大褂），所有试剂均视为潜在危险品。
G. 优化试剂盒性能
1. 精准移液：因样本体积小（5 µL），需使用精度≥10 µL的移液器，移液前擦拭吸头外侧液滴以确保准确性。
2. 防干燥：加样过程需快速，每板每步操作时间不超过10分钟，避免微孔板干燥。
3. 彻底洗涤：洗涤不充分会导致背景值升高，需严格按步骤执行洗板。
4. 平行检测：标准品和样本均需做双孔重复，降低误差。
5. 批号一致性：不同批号试剂不得混用，以免影响结果。
H. 大鼠血浆和血清的制备
H.1. 血浆制备
- 采集血液至含抗凝剂（如肝素1 U/mL、EDTA 0.1%或柠檬酸钠0.76%）的试管中，4°C下以2,000×g离心20分钟，取上清。
H.2. 血清制备
- 采集血液后室温凝固，4°C下以2,000×g离心20分钟，取上清。
H.3. 注意事项
- 避免溶血，浑浊样本需再次离心至澄清。
- 需稀释的样本必须用样本稀释液（G）稀释，不可使用其他溶液。
I. 低范围检测（0.1-6.4 ng/mL）
I.1. 试剂准备
1. 试剂平衡：使用前将所有试剂置于室温（18-25°C），用后立即放回2-8°C储存。
2. 微孔板准备：从铝箔袋中取出抗体包被微孔板（A），平衡至室温后固定在框架上，开封后需当日使用。
3. 胰岛素标准品母液：向冻干标准品（B）中加入100 µL蒸馏水，轻柔颠倒至完全溶解，得25.6 ng/mL母液，2-8°C稳定1周。
4. 酶结合物工作液：取3.6 mL酶结合物储备液（C）+1.8 mL稀释液（D），混合均匀，现用现配，避免起泡。
5. 底物溶液（E）：即用型，开封后2-8°C避光保存1周。
6. 洗涤缓冲液：将洗涤储备液（H）用蒸馏水稀释至1 L，2-8°C稳定1周。
I.2. 大鼠胰岛素工作标准品的制备（低范围）
表3. 工作标准品稀释步骤
大鼠胰岛素浓度（ng/mL）
RISS*：大鼠胰岛素储备液（25.6 ng/mL）
SD**：样本稀释液
操作步骤：
1. 在标记“6.4 ng/mL”的微管中加入50 µL标准品母液+150 µL样本稀释液，混匀。
2. 取50 µL上述溶液至“3.2 ng/mL”微管，加入50 µL样本稀释液，混匀。
3. 按倍比稀释法依次制备更低浓度标准品（0.8、0.4 ng/mL），空白孔仅加50 µL样本稀释液。
4. 标准品需临用前制备，用后丢弃，建议使用聚丙烯微管以减少胰岛素吸附。
I.3. 检测步骤（低范围）
1. 加样：每孔加入95 µL样本稀释液（G），再加入5 µL样本或标准品（0-6.4 ng/mL），双孔重复。
2. 第一孵育：覆盖微孔板盖，4°C孵育2小时。
3. 洗板：弃去孔内液体，每孔用300 µL洗涤缓冲液洗5次，每次洗完后倒扣拍干。
4. 加酶结合物：每孔加入100 µL酶结合物工作液，室温孵育30分钟。
5. 二次洗板：每孔用300 µL洗涤缓冲液洗7次，彻底拍干。
6. 显色反应：每孔加入100 µL底物溶液（E），室温避光孵育40分钟（避免用铝箔覆盖）。
7. 终止反应：每孔加入100 µL终止液（F），混匀。
8. 读数：30分钟内用酶标仪检测450 nm吸光度，扣除630 nm背景值。
I.4. 胰岛素浓度的确定
1. 计算平均值：计算标准品和样本的双孔吸光度平均值，若单孔值与均值偏差＞20%，需重新检测。
2. 绘制标准曲线：以吸光度（Y轴）为纵坐标，标准品浓度（X轴）为横坐标，用线性坐标纸绘制标准曲线（示例见图1）。
3. 样本浓度计算：根据样本吸光度从标准曲线插值得到浓度，若结果＞6.4 ng/mL，需用样本稀释液稀释后重新检测。
J. 宽范围检测（0.1-12.8 ng/mL）
J.1. 试剂准备
同低范围检测（I.1），仅标准品母液稀释步骤不同。
J.2. 大鼠胰岛素工作标准品的制备（宽范围）
表4. 工作标准品稀释步骤
RISS*：大鼠胰岛素储备液（25.6 ng/mL）
SD**：样本稀释液
操作步骤：
1. 制备12.8 ng/mL标准品：50 µL母液+50 µL样本稀释液。
2. 按倍比稀释法制备6.4-0.1 ng/mL标准品，空白孔同低范围检测。
J.3. 检测步骤（宽范围）
同低范围检测（I.3），仅标准品浓度扩展至12.8 ng/mL，孵育时间和洗板次数不变。
J.4. 胰岛素浓度的确定
1. 用半对数坐标纸绘制标准曲线（示例见图2），其他步骤同低范围检测（I.4）。
2. 若样本浓度＞12.8 ng/mL，建议用低范围检测重新定量。
1. 确定每组重复标准品或样品的平均吸光度。
注意：如果单个吸光度值与平均值的差异大于20%，建议重新进行检测。0 ng/mL标准品的平均吸光度应小于0.1。
2. 使用半对数坐标纸，以各标准品的平均吸光度值为Y轴，对应的大鼠胰岛素标准品浓度为X轴，绘制胰岛素标准曲线。图2为宽范围检测生成的典型标准曲线示例。
注意：每次进行检测时均应绘制标准曲线。
3. 样本中的大鼠胰岛素浓度通过标准曲线和每个样本的平均吸光度值进行插值计算得出。
图2 典型宽范围标准曲线（四参数拟合）
K. 高分子量检测 （1-64 ng/mL）
注意：加粗下划线的项目表示低范围和高范围测定之间的程序差异。
K.1. 试剂的制备
1. 根据低范围测定下的第 I.1 节准备所有试剂，但大鼠胰岛素储备液和抗胰岛素酶偶联物除外，应按以下详细说明制备：
大鼠胰岛素储备液-小心地向小瓶中加入 40 L 蒸馏水或去离子水，重新配制 “冻干大鼠胰岛素标准品”（标记为 “B”）。轻轻倒置样品瓶，直到内容物完全溶解。该储备液含有 64 ng/mL 大鼠胰岛素。重组的大鼠胰岛素储备液在 2-8°C 下可稳定保存一周。
抗胰岛素酶偶联物-对于六个模块（48 个孔），通过混合 2.0 mL “抗胰岛素酶偶联物储备液”（标记为 “C”）、1.0 mL “酶偶联物稀释剂”（标记为 “D”）和 6.0 mL “样品稀释剂”（标记为 “G”）来制备所需体积的抗胰岛素酶偶联物溶液，完全混合以确保溶液均匀和澄清。混合时避免起泡。
注意：抗胰岛素酶偶联物应在第二次反应之前制备，并且必须立即使用。
K.2. 工作大鼠胰岛素标准品的制备
1. 将 40 μL 大鼠胰岛素原液 （64 ng/mL） 移液到标有 64 ng/mL 的聚丙烯微管中。
2. 将 20 pL 样品稀释剂分配到 6 个聚丙烯微管中，分别标记为 1、2、4、8、16 和 32 ng/mL。
3. 将 20 μL 64 ng/mL 标准品分配到 32 ng/mL 微管中，并充分混合。
4. 将 20 pL 的 32 ng/mL 标准品分配到 16 ng/mL 微管中，并充分混合。
5. 使用剩余的微管重复此稀释方案。
6. 将 20 μL 样品稀释剂分配到一个标有 O ng/mL 的聚丙烯微管中。
注意：工作胰岛素标准品应在使用前不久制备，并在使用后丢弃。使用聚丙烯微管制备工作胰岛素标准品，因为聚丙烯对胰岛素的吸附最小。
表 5 工作大鼠胰岛素标准品的制备（高范围测定）
RISS*：大鼠胰岛素储备液 （64 ng/mL）
SD**：样品稀释剂
K.3. 检测程序
第一反应：
1. 在袋子平衡至室温后，从密封的铝箔袋中取出抗体包被的微孔板模块（标记为 “A”）。将微孔板固定在支撑框架上。
2. 在每个孔中，分配 95 pL 样品稀释液（标记为 “G”）。
3. 将 5pL 样品（或 0、1、2、4、8、16、32 和 64ng/mL 工作大鼠胰岛素标准品）移液到孔中。
注意：每个标准品和样品都应一式两份进行检测。还建议在分配小体积 （5 μL） 时使用 10 μL 或更精密的移液器
4. 用塑料微孔板盖住微孔板，并在 4°C 下孵育 2 小时。
第二反应：
5. 吸出孔内容物，并使用每孔 300 pL 洗涤缓冲液洗涤 5 次。每次洗涤后，将板倒置并在干净的纸巾上用力敲击，以去除任何残留的溶液。
6. 每孔分配 100pl 的抗胰岛素酶偶联物。
7. 用塑料微孔板盖住微孔板，并在室温下孵育 30 分钟。
第三反应：
8. 吸出孔内容物，每孔使用 300 pL 洗涤缓冲液洗涤 7 次。每次洗涤后，将板倒置并在干净的纸巾上用力敲击，以去除任何残留的溶液。
9. 立即每孔分配 100 pL 酶底物溶液，并在室温下反应 10 分钟。在酶反应过程中，避免将微孔板暴露在光线下。注意：不要用铝箔覆盖微孔板。
10. 每孔添加 100 pL 酶反应终止液（标记为 “F”）以终止酶反应。
11. 使用酶标仪在 30 分钟内测量吸光度。（测量 A450? 值并减去 A630? 值）。
K.4. 测定胰岛素浓度
1. 确定每组重复标准品或样品的平均吸光度。
注意：f 单个吸光度值与平均值相差超过 20%，建议再次进行测定。0 ng/mL 标准品的平均吸光度应小于 0.1。
2. 使用 semi-lg 方格纸，通过在 Y 轴上绘制每个标准品的平均吸光度值与 X 轴上相应的标准大鼠胰岛素浓度来构建胰岛素标准曲线。图 3 是高范围分析生成的典型标准曲线示例。
注意：每次进行测定时都应绘制标准曲线
3. 使用每个样品的标准曲线和平均吸光度值对样品中的大鼠胰岛素浓度进行插值。
注意：胰岛素浓度高（64 ng/mL 或更高）的样品应用样品稀释剂稀释并重新运行。
图 3 典型的高范围标准曲线（4 参数拟合）
大鼠胰岛素 （ng/mL）
超敏感大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒检测总结
将标有 “A”）的 ntbody-cated 微孔板放在框架上。
↓
每孔分配 95 pL 样品稀释剂（标记为 “G”）。
↓
移取 5 μL 样品（或工作大鼠胰岛素标准品）每孔。
↓
将微孔板在 4°C 下孵育 2 小时。
↓
用洗涤缓冲液洗涤每个孔 5 次。
↓
每孔分配 100 pL 抗胰岛素酶偶联物。
↓
在室温下孵育微孔板 30 分钟。
↓
用洗涤缓冲液 洗涤每个孔 7 次。
↓
分配 100 pLof 酶底物溶液（标记为 “E”）表示 well。
↓
在室温下孵育微孔板，同时避免暴露在光线下。
↓
40 分钟 - LowWide Range 检测 10 分钟 - 高范围测定
↓ ↓
通过添加 100 pL 酶来终止酶反应
↓
每孔的反应终止液（标记为 “F”）。
↓
在 30 分钟内测量 A450 并减去 A630值。
↓
使用标准曲线计算胰岛素浓度。
↓
每个孔应使用 300 pL 洗涤缓冲液洗涤。将孔完全封存，以便除去所有多余的溶液。
保证
Crystal Chem Inc. 不作任何明示或暗示的保证，但其产品的制造材料具有标准质量。买方承担因使用本产品而产生的所有风险和责任。
不保证产品的适销性，也不保证此类产品适合任何特定用途。CRYSTAL CHEM INC. 的责任不得超过购买价格的退还，在任何情况下，CRYSTAL CHEM INC. 均不对因使用本产品而直接或间接产生的特殊或间接损害或费用负责。
Crystal 公司简介：
Crystal 网址: http://www.crystalchem.com/
Crystal公司，作为美国生命科学产品领域的佼佼者，自1989年创立以来，已专注为科学界供应高质量的研究与诊断试剂盒超过二十载。公司矢志不渝地投身于糖尿病诊断试剂盒的研发，推出了涵盖大鼠和小鼠胰岛素ELISA试剂盒、大鼠和小鼠瘦素ELISA试剂盒等一系列产品。此外，Crystal公司还涉足食品过敏原检测以及DNA/RNA纯化等领域，形成了三大核心产品系列：Diabetes & Obesity（糖尿病与肥胖）、Food Safety Kits（食品安全）以及Other Essentials（其他必需品）。凭借卓越的品质和持续的创新，Crystal公司赢得了业界的广泛认可，成为众多科研机构和实验室的首选合作伙伴。
部分Crystal产品说明书：
BioTNT强烈推荐Crystal品牌的以下糖尿病类检测ELSIA试剂盒，它们在生物医学研究中具有显著优势：
一、小鼠胰岛素（Ultra Sensitive）ELISA试剂盒
货号：90080
产品特色：
- 仅需5µL样本，极大地减少了样本需求量。
- 检测范围宽广，从0.1 ng/mL到64 ng/mL，满足多样本需求。
- 使用5µL样本时，灵敏度高达50 pg/mL，确保结果准确。
适用样本：血清、血浆、细胞培养液和其他液体。
技术参数：
- 灵敏度：0.05 ng/mL
- 精确度：批内与批间变异系数均≤10.0%
- 储存条件：2-8°C
- 低范围检测：0.1 - 6.4 ng/mL
- 宽范围检测：0.1 - 12.8 ng/mL
- 高范围检测：1 - 64 ng/mL
二、大鼠胰岛素（Ultra Sensitive）ELISA试剂盒
货号：90060
产品亮点：
- 仅需5µL样本，轻松实现精准检测。
- 宽泛的动态范围，从0.1 ng/mL至64 ng/mL。
- 使用5µL样本时，即可达到高灵敏度（50 pg/mL）。
适用样本：血清、血浆、细胞培养液和流体。
技术规格：
- 灵敏度：0.05 ng/mL
- 精确度：批内与批间变异系数均≤10.0%
- 储存条件：2-8°C
- 低范围检测：0.1 - 6.4 ng/mL
- 宽范围检测：0.1 - 12.8 ng/mL
- 高范围检测：1 - 64 ng/mL
三、小鼠瘦素（Leptin）ELISA试剂盒
货号：90030
产品优势：
- 仅需5µL样本，操作简便快捷。
- 高灵敏度，可检测到200 pg/mL的瘦素水平。
- 检测范围从0.2 ng/mL到12.8 ng/mL，满足不同实验需求。
- 专为小鼠样本设计，保证实验结果的准确性。
适用样本：血清、血浆、细胞培养液和其他液体。
技术特性：
- 检测范围：0.2 - 12.8 ng/mL
- 精确度：批内与批间变异系数均≤10.0%
- 储存条件：2-8°C
这三款Crystal品牌的ELSIA试剂盒均为生物医学研究提供了高效、准确的检测手段，适用于血清、血浆、细胞培养液等多种样本类型，是糖尿病相关研究的理想选择。使用时请遵循正确的操作步骤，确保实验结果的准确性和可靠性。
Crystal Chem的毒理学试剂盒为研究人员提供了前沿且经济高效的研究分析手段，用于评估化学、生物和物理因子在生物系统中的有害影响
BioTNT公司简介
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