IF 10.6| BioTNT助力生物医学研究：生长分化因子15通过促进小胶质细胞炎症反应及吞噬作用加剧脓毒症诱导的认知与记忆障碍
2025年2月，上海交通大学医学院附属瑞金医院在国际期刊《Journal of Nanobiotechnology》上发表的，题为“Growth differentiation factor 15 aggravates sepsis-induced cognitive and memory impairments by promoting microglial inflammatory responses and phagocytosis”的论文。Lijiao Chen,Shiyuan Luo,Ting Liu同位第一作者，Ying Wang,Hongjun Huang,Yan Luo为通讯作者。
背景：脓毒症相关脑病（SAE）是由脓毒症引起的一种严重的神经病症，症状从谵妄、昏迷到长期认知功能障碍不等。SAE 被认为是一种广泛的大脑损伤，其特征是小胶质细胞的激活。然而，驱动这种激活的具体病理机制尚不明确。研究发现，生长分化因子 15（GDF15）水平在脓毒症患者中显著升高，与疾病严重程度相关，并可独立预测短期和长期的死亡风险。此外，GDF15 的血清水平与灰质体积呈负相关，并可预测老年人的认知障碍。然而，GDF15 对脓毒症引起的认知和记忆障碍的影响以及这些影响背后的机制尚不清楚。
研究信息：为检验 GDF15 在 SAE 中的作用，研究者对成年 C57BL/6J 小鼠经腹腔注射脂多糖（LPS）构建脓毒症模型，通过 ELISA 法测定小鼠血浆及脑脊液中的 GDF15 水平。建模前经脑室内注射抗 GDF15 单克隆抗体 ponsegromab，采用恐惧条件反射及新物体识别测试评估脓毒症小鼠的认知与记忆功能。利用免疫荧光及高尔基染色法评估小胶质细胞的激活及吞噬作用。此外，开展体外实验，用 LPS 刺激小胶质细胞，评估 GDF15 对炎性细胞因子产生及小胶质细胞吞噬活性的影响。通过 RNA 测序、qPCR、western blot、流式细胞术及免疫荧光实验探索相关机制。在脓毒症小鼠的脑脊液中，腹腔注射脂多糖（LPS）后GDF15水平显著升高。侧脑室注射抗GDF15抗体可减轻脓毒症小鼠的认知和记忆障碍，同时减轻海马区的小胶质细胞激活和吞噬作用，从而保护突触结构完整性。脓毒症小鼠脑内GDF15水平升高。靶向抑制GDF15可减轻小胶质细胞炎症反应及吞噬活性，改善脓毒症诱导的认知与记忆损伤。上述结果表明，GDF15是治疗SAE的重要潜在靶点。
使用产品：
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A1010A0202
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96wells
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A1010A0203
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96wells
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cust-其他引物
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200ul*10um*2
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ELISA检测
采用R&D Systems公司（美国明尼阿波利斯）的小鼠GDF15 ELISA试剂盒，严格遵循说明书步骤检测脓毒症小鼠血清及脑脊液中的GDF15浓度。类似地，使用BioTNT（中国）的小鼠IL-6和TNF-α特异性ELISA试剂盒检测BV2细胞培养上清液中IL-6和TNF-α水平。简要步骤如下：实验前将ELISA试剂盒室温平衡30分钟；样本用试剂盒稀释液稀释后加入微孔板。微孔板中设置空白孔、标准品孔、样本孔及复孔，按说明书将样本加入对应孔中。使用酶标仪（BioTek公司，美国温努斯基市）测定吸光度值，具体波长参照说明书。通过标准品浓度与吸光度值绘制标准曲线，根据标准曲线及样本稀释倍数计算样本中蛋白的准确浓度。
细胞培养与处理
五类小鼠细胞系（包括BV2小胶质细胞、C8-D1A星形胶质细胞、HT22海马神经元细胞、N2a神经母细胞瘤细胞及RAW 264.7细胞）均培养于含10%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher，美国）的DMEM培养基（BasalMedia，中国）中，保存于37°C、5% CO?的恒湿培养箱。小鼠bEnd.3脑微血管内皮细胞采用含20% FBS的DMEM培养基培养。所有细胞经LPS按指定时间处理后收集，用于定量PCR检测；BV2小胶质细胞另用于蛋白质印迹（WB）实验，其培养上清液中的蛋白通过ELISA检测。部分实验中，BV2细胞在暴露于LPS（1 μg/ml）前，分别用ERK抑制剂FR180204（Beyotime）、JNK抑制剂SP600125（Beyotime）、p38抑制剂SB203580（Beyotime）、NF-κB抑制剂BAY11-7082（TargetMoi，美国）、NRF2抑制剂ML385（Selleck，美国）或重组GDF15蛋白（200 ng/ml，R&D公司）预处理。HT22细胞则在暴露于TNF-α（10 ng/ml；PeproTech，美国）前，用重组GDF15蛋白（10、100或1000 ng/ml）预处理。
瞬时转染：BV2细胞接种于60 mm培养皿中，待融合度达80–90%后转移至12孔板（密度为8×10?个细胞/孔），孵育过夜。次日，按制造商说明书使用jetPRIME转染试剂（Polyplus，法国），以50 nM siRNA双链体转染细胞48小时。siRNA引物序列如下：
siGdf15-1
正向：5′-GCAGGCAACUCUUGAAGACUU-3′
反向：5′-AAGUCUUCAAGAGUUGCCUGC-3′
siGdf15-2
正向：5′-GUGUCACUGCAGACUUAUGAUTT-3′
反向：5′-AUCAUAAGUCUGCAGUGACACTT-3′（由BioTNT公司合成）
siNrf2
正向：5′-CAGAAAUGGACAGCAAUUATT-3′
反向：5′-UAAUUGCUGUCCAUUUCUGTT-3′。
RNA 提取和 qPCR
按照热 Fisher 公司 TRIzol 试剂说明提取总 RNA。用 NanoDrop 分光光度计（热 Fisher）评估 RNA 完整性和浓度，校准使用与 RNA 提取相同的无核酸水 1 µl。根据吸光度测定 RNA 浓度。随后用 HiScript II Q RT SuperMix（5 x）（中国 Vazyme）将 RNA 逆转录为 cDNA。cDNA 稀释 10 倍用于后续实验。qPCR 使用 Axygen（美国）96 孔或 384 孔反应板。Gapdh 作内参，用 2−ΔΔCt 法确定基因表达变化。引物序列：Gdf15 正向 5′-AATGCCTGAACAGCGACCCTC-3′，反向5′-CCTGGAAGCGACCCCGTAG-3′（购自BioTNT）；Nrf2正向5′-CTGAACTCCTGGACGGGACTA-3′，反向5′-CGGTGGGTCTCCGTAAATGG-3′；Il-6正向5′-ACCAAGACCATCCAATTCATC-3′，反向5′-CTGACCACAGTGAGGAATGTC-3′（购自BioTNT）；Il-1β 正向5′-GCTTCAGGCAGGCAGTATC-3′，反向5′-AGGATGGGCTCTTCTTCAAAG-3′；Tnf-α正向5′-CCTGTAGCCCACGTCGTAG-3′，反向5′-GGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′；Ccl-2正向5′-TAAAAACCTGGATCGGAACCAAA-3′，反向5′- GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3′。
结果：
微胶质细胞是 LPS 诱导脓毒症小鼠大脑中 GDF15 的主要来源。（A-B）通过 qPCR 分析从 LPS 诱导的脓毒症小鼠的皮质（A）和海马（B）分离的原代细胞中 Gdf15 mRNA 的表达。（C）脓毒症小鼠海马中 Iba1 和 GDF15 的免疫荧光染色代表性图像。红色为 Iba1，绿色为 GDF15，蓝色为 DAPI；比例尺为 50 μm 和 5 μm。（D）量化（C）中 GDF15+Iba1+/Iba1+ 细胞的比例。（E）用 LPS（1 µg/ml）处理指定时间后，检测各细胞中 Gdf15 mRNA 的表达。（F）用 LPS（1 µg/ml）处理 6 小时后 BV2 细胞的火山图。红色为上调基因，蓝色为下调基因。（G）Western blot 显示用 LPS（1 µg/ml）处理指定时间后，BV2 细胞（上图）和原代小胶质细胞（下图）中 GDF15 蛋白的表达。（H）用 LPS（1 µg/ml）处理指定时间后，BV2 细胞培养上清中 GDF15 浓度的 ELISA 检测。（I）用不同浓度的 LPS 处理 3 小时后，BV2 细胞中 Gdf15 mRNA 的 qPCR 检测。GAPDH 用作 qPCR 的内源性参考。柱状图表示均值±标准误差（mean±SEM）。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001
在 LPS 刺激的小胶质细胞中，GDF15 通过 NRF2 信号通路被上调。（A）用 TLR4 下游通路抑制剂（包括 ERK 抑制剂 FR180204、JNK 抑制剂 SP600125、p38 抑制剂 SB203580 和 NF-κB 抑制剂 BAY11-7082）预处理 BV2 细胞 30 分钟后，再用 LPS（1 µg/ml）处理 3 小时，通过 qPCR 分析 Gdf15 mRNA 的表达。（B）用 LPS（1 µg/ml）处理指定时间后，BV2 细胞中 Nrf2 mRNA 的 qPCR 检测。（C）用 NRF2 抑制剂 ML385 预处理 BV2 细胞 24 小时后，再用 LPS（1 µg/ml）处理 3 小时，通过 qPCR 分析 Nrf2 mRNA 的表达。（D）转染 Nrf2 siRNA 48 小时后，BV2 细胞中 Nrf2 mRNA 的 qPCR 检测。（E）转染 Nrf2 siRNA 48 小时后，BV2 细胞中 NRF2 蛋白表达的 Western blot 检测。（F）转染 Nrf2 siRNA 48 小时后，再用 LPS（1 µg/ml）处理指定时间，通过 qPCR 分析 Gdf15 mRNA 的表达。GAPDH 用作 qPCR 的内源性参考。柱状图表示均值±标准误差（mean±SEM）。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001
GDF15沉默通过调节NF-κB信号减少LPS刺激的小胶质细胞炎症因子产生。（A）BV2细胞转染Gdf15 siRNA 48小时后经LPS（1 µg/ml）处理6小时的炎症因子mRNA表达热图。（B-E）qPCR分析BV2细胞（左图）和原代小胶质细胞（右图）转染Gdf15 siRNA 48小时后，经LPS（1 µg/ml）处理不同时间的Il-6（B）、Il-1β（C）、Tnf-α（D）和Ccl-2（E）mRNA表达。（F-G）ELISA检测BV2细胞转染Gdf15 siRNA 48小时后经LPS（1 µg/ml）处理12小时的上清中IL-6和TNF-α产生。（H）qPCR分析BV2细胞预处理重组GDF15（200 ng/ml）30分钟后经LPS（1 µg/ml）处理3小时的Il-6 mRNA表达。（I）Western blotting显示BV2细胞转染Gdf15 siRNA 48小时后经LPS处理不同时间的磷酸化p65、p38、ERK和JNK及总蛋白水平。GAPDH用作qPCR的内源性参考。柱状图表示均值±标准误差（mean±SEM）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
结论：总之，这项研究结果表明，向侧脑室注射抗 GDF15 单克隆抗体可显著改善 SAE 的认知和记忆障碍，减少小胶质细胞激活，并增强突触活性。这些治疗效果至少部分是通过调节 NF-κB 信号通路实现的。研究结果表明，靶向中枢神经系统中的 GDF15 可能为 SAE 的早期干预和管理提供一种有前景的治疗策略。