IF 14.3| BioTNT助力生物医学研究：基于单细胞RNA测序分析揭示CCN2介导膝关节纤维化中的成纤维细胞-巨噬细胞相互作用
2025年2月，上海交通大学附属第六人民医院在国际期刊《Bone Research》上发表的，题为“CCN2 mediates fibroblast-macrophage interaction in knee arthrofibrosis based on single-cell RNA-seq analysis”的论文。Ziyun Li,Jia Jiang,Kangwen Cai同位第一作者，Xiaoqi Zheng, Ning-Ning Liu, Jinzhong Zhao为通讯作者。
背景：膝关节粘连（Knee Arthrofibrosis, AF）是一种以膝关节主动伸展和/或屈曲活动范围（Range of Motion, ROM）受限为特征的疾病，通常并非由感染或其他特定因素引起。它是膝关节手术后常见的并发症，其发生率在前交叉韧带（Anterior Cruciate Ligament, ACL）重建术后为2%至35%，在全膝关节置换术后为0.2%至10%。在美国，每年大约有近300万患者接受与膝关节粘连相关的手术治疗。尽管在关节松解手术（包括关节镜手术和开放手术）方面取得了相当进展，但对膝关节粘连的治疗效果仍不尽如人意。膝关节粘连患者会经历日常功能的逐渐丧失，包括跑步和下蹲能力的下降，最终甚至无法坐下或爬楼梯，从而导致极大的痛苦和巨大的经济负担（与全膝关节置换术的初次手术相比，住院费用增加了超过7000美元）。因此，迫切需要开展相关研究以预防和治疗膝关节粘连。膝关节粘连的确切发病机制仍然未知，导致缺乏可靠的生物标志物和治疗靶点。
研究信息：在此，我们通过结合流式细胞术和单细胞RNA测序分析，对6例有或无膝关节粘连的患者的滑膜组织中的异质性细胞群体和细胞通路进行了表征。与阴性对照组相比，粘连组中巨噬细胞和成纤维细胞数量增加，而类似滑膜细胞的成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和T细胞数量减少。值得注意的是，发现成纤维细胞与巨噬细胞相互作用，并通过TGF-β通路诱导成纤维细胞中CCN2的表达，从而导致纤维化。CCN2被证明通过TGFBR/SMAD通路对成纤维细胞的促纤维化功能（激活、增殖和迁移）是必需的。在另一组膝关节粘连患者中，CCN2的表达与胶原蛋白体积和TGF-β表达呈正相关，与患者报告的结果测量呈负相关。我们的研究揭示了CCN2在TGF-β通路中的成纤维细胞-巨噬细胞相互作用中的作用，这可能有助于阐明CCN2作为一种潜在生物标志物的作用。
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A20120A0701
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100ul
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Western blot分析
成纤维细胞使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液进行裂解，随后使用BCA蛋白定量试剂盒（#P0011，Beyotime）检测蛋白浓度。将等量的蛋白样品加载到10%聚丙烯酰胺凝胶中，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用含有5%脱脂奶粉的TBS/Tween-20溶液在室温下封闭1小时。随后，膜在4°C下与一抗孵育过夜，包括抗CTGF（#ab209780，Abcam，1:1000）、抗αSMA（#ab124964，Abcam，1:1000）、抗COL1（#14695-1-AP，Proteintech，RRID: AB_2082037，1:1000）和抗GAPDH抗体（#A20120A0701，Biotnt，1:1000）。之后，膜在室温下与抗兔IgG（#A20120A0704，Jackson ImmunoResearch，RRID: AB_2337913）孵育1小时，并按照标准流程进行显色。条带信号通过Image J软件（v 2.0.0）进行定量分析。
结果:
CCN2的敲低通过下调TGFBR/SMAD信号通路减弱了成纤维细胞的促纤维化功能。a, b 使用RT-qPCR和Western blotting检测CCN2在siCCN2（针对CCN2的siRNA）或siNC（非靶向对照siRNA）处理下的表达水平（n=3）。c–h 在转染后的成纤维细胞中，用TGF-β（4 ng/mL）培养后，通过RT-qPCR和Western blotting分析CCN2及其他激活标志物（αSMA和COL1）的表达水平（n=3）。i 使用CCK-8实验在不同时间间隔测量转染细胞的增殖情况（n=3）。j 通过划痕实验评估细胞迁移能力（n=3）。左侧为代表性图像（原始放大倍数，×40）。条形=200 µm。右侧为多个时间间隔的迁移面积比率。k, l 在转染后的成纤维细胞中，用TGF-β（4 ng/mL）培养后，通过RT-qPCR分析TGFBR1和SMAD3的表达水平（n=3）。m左侧：在TGF-β（4 ng/mL）刺激后，转染成纤维细胞中TGFBR1和SMAD3的代表性免疫荧光图像。右侧：条形图显示TGFBR1和SMAD3的相对荧光强度。OD，光密度；P < 0.05；* P < 0.01；*** P < 0.001；**** P < 0.0001。数据以均值±标准差（SD）表示。
结论：在本研究中，我们通过体外实验确认了TGF-β刺激诱导CCN2的表达，并发现通过敲低CCN2，可以显著抑制TGF-β刺激下的促纤维化功能（激活、细胞增殖和迁移），这主要是由于TGFBR/SMAD信号通路的下调。这些发现为膝关节粘连增加了一条新的途径，即“成纤维细胞自分泌回路”，其中TGF-β诱导CCN2，而CCN2反过来又放大了TGF-β的功能。在另一组患者中，我们观察到AF组中成纤维细胞、肌成纤维细胞和巨噬细胞的共定位，表明这些细胞之间可能存在相互作用。此外，我们发现CCN2的H评分与胶原体积分数（CVF）和TGF-β的H评分呈正相关，但与多个与膝关节相关的患者报告结果测量（Lysholm、IKDC、KOOS-症状、KOOS-疼痛、KOOS-ADL、KOOS-运动/娱乐）呈负相关。这些临床结果也表明，过表达的TGF-β会导致CCN2过度表达，这在导致患者不良结果的纤维化中可能是至关重要的。因此，考虑到疾病的特异性，CCN2可以作为预后的良好辅助生物标志物。此外，随着针对CCN2的强有力的临床试验和药物（如FG-3019、普伐他汀等）的开展，CCN2也可能成为膝关节粘连的有前景的治疗靶点，具有高精准度。