IF 15.1| BioTNT助力生物医学研究：糖酵解衍生的乳酸通过诱导ACSL4表达和乳酸化激活椎间盘退变过程中的铁死亡
2025年4月，海军军医大学长征医院在国际期刊《Advanced Science》上发表的，题为“Glycolysis-Derived Lactate Induces ACSL4 Expression and Lactylation to Activate Ferroptosis during Intervertebral Disc Degeneration”的论文。Kaiqiang Sun, Yangyang Shi, Chen Yan, Shunmin Wang同位第一作者，Jingchuan Sun,Zijian Kang,Jiangang Shi为通讯作者。
背景：椎间盘退变（IVDD）是一种极为常见的慢性退行性疾病，影响着各个年龄段的人群，全球有超过5.6亿人受到影响。它是导致残疾的主要原因之一，导致显著的医疗成本、生产力下降和生活质量降低，从而对全球医疗系统造成了巨大的社会经济负担。腰痛（LBP）是最常见的症状，在全球范围内，超过80%的人在其一生中会受到影响。IVDD的临床治疗主要包括保守治疗和手术治疗，然而，这两种方法都无法延缓IVDD的病理生理进程，而手术相关的并发症严重影响患者的生活质量。髓核细胞（NPC）功能障碍是IVDD的一个关键特征。健康的髓核组织以充足的细胞外基质（ECM）和适当分散的NPC为特征。然而，由于机械刺激或炎症反应，ECM的代谢稳态受到干扰，表现为II型胶原和软骨素的合成减少，以及I型/III型胶原、基质金属蛋白酶（MMPs）和含有血栓素模序的解整合素金属蛋白酶（ADAMTSs）的分泌增加。因此，I型/III型胶原和MMP2/3/13水平的增加使髓核组织的表型向成纤维细胞样表型转变。然而，尽管IVDD的患病率很高，但由于对疾病发病机制缺乏深入的了解，目前尚无有效的疾病调节疗法。能量代谢是细胞功能的重要调节因子，异常的能量供应常常导致各种疾病的发病。IVDD和骨关节炎（OA）在病理生理上有许多相似之处，两者都是以低度炎症和ECM代谢失衡为特征的与年龄相关的退行性功能障碍。IVDD和OA之间的相似性主要取决于NPC和软骨细胞。据报道，在关节炎中，软骨细胞在OA期间经常发生代谢重塑。由于缺氧环境，软骨细胞主要依靠糖酵解获取能量，使葡萄糖成为其主要的代谢燃料。然而，在OA期间，氧气和营养物质的供应受到干扰，从而增强了糖酵解。此外，持续激活的葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）可以通过产生晚期糖基化终产物（AGEs）诱导软骨中蛋白多糖的耗竭。同样，NPC的主要能量来源是葡萄糖糖酵解。缺氧诱导因子（HIF-1α）在NPC中高表达，以适应缺氧环境。Kim等人揭示，持续激活HIF-1α信号通路通过增强糖酵解在IVDD中发挥保护作用。然而，Wang等人最近报道，退变性人类和小鼠IVD中HIF-1α信号上调，异常激活的HIF-1α信号增加了年龄依赖性IVDD的风险，伴随着糖酵解代谢增强和线粒体功能受损。因此，糖酵解对IVDD的确切影响尚不清楚
研究信息：本研究旨在揭示髓核细胞（NPCs）在IVDD期间的代谢变化，并探讨糖酵解衍生乳酸对NPCs的作用机制。单细胞RNA测序显示，在IVDD期间，NPCs以糖酵解显著增强为特征，而由此产生的乳酸通过激活铁死亡导致NPCs功能障碍。从机制上讲，乳酸通过促进组蛋白H3K18的乳酸化修饰，导致长链酰基辅酶A合成酶家族成员4（ACSL4）的转录。有趣的是，乳酸还可以增加ACSL4在K412位点的乳酸化修饰。此外，乳酸诱导的Sirtuin-3（SIRT3）表达降低，进一步导致ACSL4乳酸化水平升高。最后，动物实验表明，通过腺相关病毒9（AAV9）介导的基因沉默或使用2-脱氧-D-葡萄糖进行化学处理抑制糖酵解，可以抑制乳酸的产生和乳酸化，从而减轻铁死亡和NPC功能障碍。本研究的结果表明，乳酸通过激活铁死亡在IVDD中发挥关键作用，针对乳酸产生的干预措施可能为IVDD患者提供一种潜在的治疗选择。
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双荧光素酶报告实验
通过Target Scan软件预测miR-708-5p与SIRT3的结合序列。将包含miR-708-5p（由BioTNT公司提供）野生型（WT）或突变型（MUT）结合位点的SIRT3 3′-非翻译区（3′-UTR）片段插入pmirGLO载体（Promega）。随后，利用Lipofectamine 3000（Invitrogen）将人SIRT3 3′-UTR片段与miR-708-5p模拟物共转染至人髓核细胞（NPCs）中。转染48小时后，采用双荧光素酶检测试剂盒（Promega）测定荧光素酶活性，并以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化。
结果：
miR-708-5p或可成为乳酸调控SIRT3的潜在桥梁A) 采用三种算法（TargetScan、mirDIP及miRDB）预测靶向SIRT3 mRNA的候选miRNA。B) 乳酸处理人髓核细胞（NPCs）24小时后，通过qPCR检测miR-708-5p表达水平。C) miR-708-5p与SIRT3 3′-UTR野生型（WT）及突变型（MUT）结合位点的序列比对。D) 将SIRT3 3′-UTR野生型或突变型报告质粒与miR-708-5p模拟物共转染至人髓核细胞，转染48小时后采用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。数据以均值±标准差表示，统计学显著性通过单因素方差分析确定。P < 0.01，*P < 0.001。
结论：综上，在不利应激条件下，髓核细胞（NPCs）发生代谢重编程，糖酵解途径异常激活。乳酸的过量生成与堆积通过促进ACSL4的基因转录及乳酸化修饰驱动铁死亡发生，且乳酸诱导的H3K18la水平升高与SIRT3表达下调进一步导致ACSL4乳酸化增强。然而，通过基因沉默或化学干预抑制糖酵解可减少乳酸生成，缓解椎间盘退变（IVDD）进程中的铁死亡激活及髓核细胞功能障碍。本研究揭示了乳酸-铁死亡调控轴在椎间盘退变中的核心作用，提示靶向乳酸生成或跨膜转运可能成为治疗椎间盘退变的新策略。