IF 16.16| BioTNT助力生物材料研究：用于无损伤抗炎的基于原子级薄半导体的神经形态电刺激
2024年2月，上海交通大学附属上海市第六人民医院在国际期刊《Nature Communications》上发表的，题为“Neuromorphic electro-stimulation based on atomically thin semiconductor for damage-free inflammation inhibition”的论文。Rong Bao, Shuiyuan Wang, Xiaoxian Liu同位第一作者，Shuiyuan Wang, Peng Zhou, Shen Liu为通讯作者。
背景：炎症是机体对创伤、感染、手术、烧伤、缺血或坏死组织等有害刺激的防御反应，主要表现为红、肿、热、痛及功能障碍。其中，肌腱损伤后的急性炎症是免疫细胞释放炎性细胞因子积聚引发的典型病理过程，可导致肌腱愈合不良及腱周粘连形成，严重影响患者运动功能。降低急性炎症因子水平可有效抑制腱周炎症，但单纯药物治疗效率低下且存在心血管与泌尿系统副作用。生物材料载药系统虽可通过控释增效减毒，但仍面临肌腱再断裂、感染及异物炎性反应等风险。外周神经电刺激（ES）通过调控生物电信号、神经递质干预炎症细胞活性，为抗炎治疗提供新思路。迷走神经刺激曾作为主流方案，其通过刺激传入纤维传递信号，经传出迷走神经或交感干调控靶器官炎症。常规刺激电流为0.25～0.8 mA，过高电流易致组织损伤。目前常用电针或手针进行间接刺激，虽微创但非定向刺激需更高电流强度。值得注意的是，电针刺激因针体置于体表组织（远离神经束）虽不直接损伤神经元，但缺乏神经精准调控导致疗效受限，需更高电流补偿。此外，迷走神经作为混合性脑神经包含四类神经纤维，刺激可能引发头痛、呼吸困难、心脏并发症等副作用。降低并发症的关键在于实现非混合神经的无损刺激。交感神经作为脊髓发出的传出神经，具有纤维组成单一、抗炎通路明确等优势。现有交感刺激多采用腹腔内脾神经，虽在小鼠类风湿性关节炎模型中显示抗炎效果，但对肌腱损伤的疗效仍属空白。且开腹手术显著增加感染风险。交感链神经节（SChG）作为椎旁神经节，主要含节后纤维并支配靶器官。其腰段走行于膈肌与腰大肌间，沿腹主动脉延伸至腹膜后间隙。该通路通过直接刺激交感神经可降低手术创伤，较开腹更具安全性。尽管电针通过感觉神经间接刺激小鼠交感神经可避免手术损伤，但仍存在路径不精准、疗效不稳定、机制不明确等问题，且高达3 mA的刺激电流仍可能造成神经损伤。不恰当的刺激路径不仅增加感染风险，高电流刺激更易导致神经损伤，无论侵入性或非侵入性方式均存在此问题。此外，非优化的刺激脉冲形态可能加剧神经损伤。基于传统CMOS技术的商用刺激器输出固定幅值的突变脉冲，其波形不可编程且与生物电信号差异显著。现有仿生脉冲设计常以增加器件体积和功耗为代价，影响植入适用性。为达到治疗效果，低仿生度的脉冲波形需更高电流补偿，这对目标神经具有潜在危害。神经形态电刺激通过仿生脉冲可在低电流下实现治疗效果并降低生物损伤，在调控肌肉收缩与肢体运动方面已获成功。以二硫化钼（MoS2）为代表的二维原子薄半导体凭借优异特性，在仿生传感与神经形态工程领域展现潜力。其超薄结构赋予低工作电压与能耗优势，且在外场调控下具有可编程特性，可输出仿生脉冲，兼具生物相容性与植入扩展潜力。
研究信息：本研究开发了基于二硫化钼浮栅存储器叉指电路（MoS2 FGM-IDC）的神经形态电刺激系统，通过直接刺激交感链抑制肌腱损伤炎症。我们在腹膜后间隙定位交感链，采用柔性电极包裹实现损伤肌腱节段的精准刺激。所构建的MoS2浮栅存储器展现出优异的类突触长时程可塑性，可编程输出仿生脉冲以降低神经损伤。实验表明，二维电刺激使炎症因子IL-6水平下降73.5%。得益于神经直接刺激与仿生脉冲技术，该系统在0.175 mA创纪录低电流下较商用刺激器进一步降低IL-6水平70.6%，且交感神经元无损伤。基因敲除实验证实，髓系细胞（单核/巨噬细胞与粒细胞）表面的β2肾上腺素能受体（ADRB2）介导了交感电刺激的炎性因子下调。该研究为开发低损伤神经形态电刺激技术提供了新思路，为炎症调控与并发症防控带来重要启示。
使用产品：
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A1010A0210
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96wells
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ELISA
将含有肌肉和结缔组织的肌腱周围组织样本用于ELISA检测。每份组织约20 mg，置于1.6 ml EP管中，加入100 μl PBS缓冲液，使用超声研磨机进行研磨。随后将组织样本在4°C条件下以5000 × g离心5分钟，收集上清液用于ELISA分析。使用ELISA试剂盒按照制造商说明检测IL-6（MEC1008，Anogen）、TNF-α（MEC1003，Anogen）、IL-10（A1010A0210，Biotnt）和IL-1β（MEC1010，Anogen）的浓度。简要步骤如下：将50 µL标准品或稀释样本加入抗体预包被微孔板的对应孔中，在室温下孵育1小时。使用自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤后将板倒置并在吸水纸或纸巾上拍打至无残留水痕。向每孔加入50 µL抗IL-6生物素偶联物，室温孵育1小时。洗涤后加入亲和素-HRP偶联物，室温孵育1小时。再次洗涤5次后，将样本与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）显色试剂在避光条件下室温孵育15分钟。当标准品孔呈现明显颜色梯度时，加入100 µL终止液终止反应。使用450 nm波长测定各孔吸光度，根据标准曲线计算各样本对应蛋白浓度。去甲肾上腺素（NE）（BA E-6200，LDN）采用ELISA试剂盒按类似制造商说明进行检测，分析前需使用顺式二醇特异性亲和凝胶提取去甲肾上腺素（去甲肾上腺素），随后进行酰化处理和酶促衍生化。
结果：
在假手术（sham）、非电刺激（non-ES）、经皮电刺激（t-ES，0.175 mA）和二维电刺激（2D ES，约0.175 mA）组之间，肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）和白细胞介素1β（IL-1β）的水平如下：a.假手术组与非电刺激组之间TNF-α水平无显著差异，但与非电刺激组相比，二维电刺激组的TNF-α水平仍有所降低。b-c.与非电刺激组和0.175 mA经皮电刺激组相比，二维电刺激组的IL-10和IL-1β水平均降低。每组样本量为5只小鼠；采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。对于TNF-α，F3,16 = 3.979，p = 0.027；事后Tukey检验结果显示：p = 0.0224（假手术组与非电刺激组），p = 0.4154（假手术组与0.175 mA经皮电刺激组），p = 0.8182（假手术组与二维电刺激组），p = 0.3617（非电刺激组与0.175 mA经皮电刺激组），p = 0.8922（非电刺激组与二维电刺激组），p = 0.0877（0.175 mA经皮电刺激组与二维电刺激组）。对于IL-10，F3,16 = 54.82，p < 0.0001；事后Tukey检验结果显示：p < 0.0001（假手术组与非电刺激组），p = 0.7188（假手术组与二维电刺激组），p = 0.9883（非电刺激组与0.175 mA经皮电刺激组）。对于IL-1β，F3,16 = 16.77，p < 0.0001；事后Tukey检验结果显示：p = 0.0102（假手术组与非电刺激组），p = 0.0268（假手术组与二维电刺激组），p = 0.0009（假手术组与0.175 mA经皮电刺激组），p < 0.0001（非电刺激组与二维电刺激组），p = 0.3708（假手术组与0.175 mA经皮电刺激组），p = 0.2317（非电刺激组与0.175 mA经皮电刺激组）。
结论：我们展示了一种基于单层二硫化钼（MoS?）浮栅存储器（FGM）集成器件（IDC）的类脑电刺激（ES）技术，并通过柔性电极包裹交感神经链，直接刺激以抑制可能导致肌腱粘连的急性炎症。二维MoS? FGM表现出卓越的性能，包括超快速操作（100纳秒）、非易失性保持（1000秒）和强大的耐久性（1000次循环）。MoS? FGM具有生物模拟可编程性，能够模拟生物突触中的渐进可塑性，并发射类脑生物电子脉冲。随后，我们分离了交感神经链，并直接向支配肌腱的神经节段传递电刺激。在植入并人为引入肌腱损伤后，与未接受电刺激的小鼠相比，接受二维电刺激的小鼠体内炎症相关细胞因子IL-6减少了73.5%。此外，得益于直接的、可编程的生物电子刺激脉冲，这种类脑二维电刺激比商业刺激器（固定为0.175毫安）表现出更好的效果。在相同刺激时长（15分钟）和无损伤电流（平均幅度约为0.175毫安）的刺激下，IL-6进一步减少了70.6%。此外，我们通过基因敲除技术验证了髓系细胞谱系（单核细胞/巨噬细胞和粒细胞）上的β2肾上腺素能受体（ADRB2）介导了交感神经电刺激对炎症相关细胞因子的降低。这项工作展示了基于二维FGM IDC的类脑电刺激，并为治疗炎症性疾病以及预防由神经损伤引起的并发症提供了一种有效的策略。然而，必须承认，由于设备的规模集成限制以及生物手术的侵入性，这种提出的生物电子刺激解决方案仍处于实际临床应用的初级阶段。未来，通过微创手术植入无线供电的柔性芯片，整合FGM电路和电极，以及非侵入性经皮刺激，可能是类脑生物电子电刺激解决方案走向实际临床应用的可能方向。