IF 17.521| BioTNT助力生物材料研究：用于感染性经皮组织修复的聚吡咯涂层磺化聚醚醚酮的近红外刺激下的“开-关”吞噬作用和可切换巨噬细胞激活
2022年12月，中国科学院上海硅酸盐研究所在国际期刊《Advanced Science》上发表的，题为“On-Off Phagocytosis and Switchable Macrophage Activation Stimulated with NIR for Infected Percutaneous Tissue Repair of Polypyrrole-Coated Sulfonated PEEK”的论文。Xingdan Liu为第一作者，Xuanyong Liu, Liping Ouyang, Yun Liao为通讯作者。
背景：随着疾病、交通事故和人口老龄化的增加，对经皮植入物的需求迅速增长。聚醚醚酮（PEEK）因其良好的生物相容性、机械性能和化学稳定性，常被用作骨科、牙科植入物及介入治疗手术器械的替代材料。然而，PEEK生物惰性且无抗菌能力，导致植入物与组织之间生物结合性差，可能引发手术失败。近年来，磺化技术被应用于赋予PEEK多孔结构，且已被广泛验证具有良好的杀菌和组织修复能力。然而，磺化层受损的机械性能仍是磺化PEEK（SP）临床应用的最大障碍。因此，在获得优越的杀菌和组织修复性能的同时，应改善SP的机械性能。经皮植入物的成功依赖于抵抗细菌感染以及植入物表面与软组织的生物愈合。由于经皮植入物的服务环境相对开放且复杂，其感染风险较高。特别是，与生物膜相关的植入物感染约占医疗环境中所有细菌感染的65%。生物膜的形成使一些抗菌材料失效，并通过生物膜基质抑制宿主免疫和抗生素渗透，从而延长治疗周期。因此，必须为临床实践中的经皮植入物疗法开发具有优越抗菌性能的SP材料。
研究信息：智能控制免疫反应对于获得具有良好杀菌能力和组织修复能力的经皮植入物至关重要。在本研究中，构建了包裹在磺化聚醚醚酮（SP）表面三维框架上的聚吡咯（Ppy）纳米颗粒，通过形成类似钢筋混凝土的协同结构，增强了磺化层的表面模量和硬度，并展现出卓越的光热效应。Ppy涂层的SP能够在响应808纳米近红外（NIR）光时迅速在表面聚集热量，从而杀死细菌并破坏生物膜。在NIR刺激下，培养在Ppy涂层SP上的巨噬细胞的吞噬作用和M1型激活通过激活补体3及其受体CD11b得到增强。随着NIR刺激的取消，Ppy涂层SP组的吞噬作用和M1型激活受到抑制，这有利于组织修复。由于表面模量较高，Ppy涂层SP通过诱导M2型极化促进I型胶原蛋白、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子和α-平滑肌肌动蛋白（Acta2）的表达。总体而言，具有增强机械性能的Ppy涂层SP可能是一种通过NIR刺激实现“开-关”吞噬作用和可切换巨噬细胞激活的临床经皮植入物的良好候选材料。
使用产品：
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产品货号
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cust-其他引物
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200ul*10um*2
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A20120A0101
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50ml
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为了进行体内评估，小鼠在植入后7天和14天被过量麻醉处死，部分植入物周围的组织被储存在液氮中。通过RT-PCR定量分析了各组组织中与吞噬作用相关的基因（TNF-α、C3和CD11b基因）、与炎症相关的基因（诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-6、IL-4、TGF-β基因）以及与组织修复相关的基因（I型胶原蛋白（COL-I）、血管内皮生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（Acta2）基因）的表达。RT-PCR使用罗氏公司的LightCycler 480系统进行。所有引物均购自BioTNT，并列于补充信息中的表S1。
Western Blot分析：通过Western Blot分析定量检测上述组织中C3蛋白的水平。具体而言，组织样本使用RIPA裂解缓冲液（A20120A0101，BioTNT）进行裂解，随后利用双缩脲酸（BCA）试剂盒（1-PC0020，Solarbio）定量分析总蛋白水平。之后，蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜在含有5%（质量/体积比）脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）-Tween 20缓冲液中封闭1小时，随后在4°C下与针对C3和GAPDH的一抗（1:2000；1:1000；Abcam，美国）孵育过夜。之后，膜用TBS-Tween 20冲洗三次，并在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时。再次冲洗后，使用ChemiScope 6100系统（CLiNX，中国）观察蛋白条带，并通过Image J软件对蛋白条带的强度进行定量分析。
结果：
巨噬细胞在经NIR照射的样品上的炎症反应和吞噬效率。a)在不同功率密度（单位：W cm?²）的NIR处理下，各组巨噬细胞培养的炎症细胞因子释放水平。&：与未接受NIR处理的相同组别进行比较；*：在相同功率密度下，不同样品之间进行比较。b)在不同功率密度（单位：W cm?²）的NIR处理下，SPPM样品上培养的巨噬细胞中炎症相关基因的表达。c)在NIR处理下，SPPM组中TLR4–MyD88–NF-κB1信号通路中相关基因的表达（单位：W cm?²）。d)在0.5 W cm?²的NIR处理下，SP和SPPM样品上培养的巨噬细胞对PS微球的吞噬率以及细胞吞噬过程的示意图。数据以均值±标准差（n=3）表示。通过t检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）、双因素方差分析（two-way ANOVA）以及Tukey多重比较检验计算统计显著性。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。&p < 0.05；&&p < 0.01。
吞噬信号通路。a)吞噬信号通路中的基因表达。"-"：未接受NIR照射的材料；"+"：在功率密度为0.5 W cm?²的NIR照射下的材料。b) TNF-α蛋白的免疫组化染色。c) C3补体蛋白及其分支链的Western blot鉴定。d)对应蛋白表达的定量分析。e)通过免疫组化染色对TNF-α蛋白进行定量分析。f)在经皮植入感染模型中，植入后7天和14天时，周围组织中的巨噬细胞、CD11b蛋白和细胞核标记物（F4/80：绿色；CD11b：红色；细胞核：蓝色）。g)吞噬通路机制的示意图。数据以均值±标准差（n=3）表示。通过双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验计算统计显著性。与SP-组相比，*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。与SPPM-组相比，&p < 0.05。与SP+组相比，#p < 0.05。
经皮植入感染模型中的组织愈合评估。a)使用经皮植入感染模型观察组织愈合的示意图。功率密度为0.5 W cm?²的近红外光（NIR）照射，持续5分钟。b) Masson染色图像及c)对应的定量分析。d) I型胶原蛋白（COL-I）的免疫组化染色图像及e)对应的定量分析。f)血管内皮生长因子（VEGF）的免疫组化染色图像及g) 对应的定量分析。h)苏木精-伊红（H&E）染色图像及i) 中性粒细胞计数。j)植入后7天和14天时，各组周围组织的炎症相关基因表达。数据以均值±标准差（n=3）表示。通过双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验计算统计显著性。与SP-组相比，*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001。与SPPM-组相比，&p < 0.05；&&p < 0.01；&&&p < 0.001；&&&&p < 0.0001。与SP+组相比，#p < 0.05；##p < 0.01；###p < 0.001；####p < 0.0001。
经皮植入模型中的组织愈合情况。a)模型构建过程的示意图。b) 植入后7天和14天时与组织愈合相关的基因表达水平。c) Masson染色图像；d) I型胶原蛋白（COL-I）的免疫组化染色图像；e)血管内皮生长因子（VEGF）的免疫组化染色图像；f)苏木精-伊红（H&E）染色图像；g)在SP组和SPPM组周围组织中，标记巨噬细胞表型（M1：CCR7，绿色；M2：CD206，红色；DAPI：蓝色）的免疫荧光染色图像，分别在7天和14天时拍摄。h)在7天和14天时炎症相关基因的表达水平。数据以均值±标准差（n=3）表示。通过双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验计算统计显著性。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。
在不同样品上培养的巨噬细胞中炎症相关基因的表达。数据以均值±标准差（n=3）表示。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）计算统计显著性。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001。
在不同样品上培养的L929细胞中与组织愈合相关的基因表达。数据以均值±标准差（n=3）表示。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）计算统计显著性。*p < 0.0001。
结论：在本研究中，聚吡咯（Ppy）在磺化聚醚醚酮（SP）的三维多孔有限域中原位生长，改善了SP的表面力学性能。在细菌感染阶段，Ppy涂层的SP能够响应808 nm近红外光（NIR）刺激，在表面聚集热量，从而杀死细菌并迅速破坏细菌生物膜。在NIR刺激下，Ppy涂层SP还能通过增加补体3（C3）及其受体CD11b的表达，增强植入物表面巨噬细胞的吞噬活性和M1型激活，从而在体内清除游离细菌。在细菌控制阶段，通过关闭NIR照射可以关闭吞噬作用。此外，由于缺乏NIR处理，巨噬细胞因SP表面模量较高而转向M2型，这增加了I型胶原蛋白（COL-I）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，并调节成纤维细胞以促进组织愈合。本研究通过NIR刺激实现的“开-关”吞噬作用和可切换的巨噬细胞激活，为经皮植入物提供了一种候选材料。