Real time PCR mRNA 定量实验路线选择F&Q
问题一：Real time PCR mRNA的相对定量和绝对定量的选择；
测定mRNA, 一般采用相对定量，因为绝对定量，标准品的制备和定量是有难度的，具体可以参考这篇文献：http://www.BioTNT.com/news/news_105.htm；
“Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method”
Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen
Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and †Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534
问题二：Real time PCR 的染料法和探针法的选择；
答：进行mRNA表达量的测定，采用染料法是比较经济实惠的；染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况；目的基因和内参基因分管检测；
染料法可以选用Real time 染料PCR PreMIX，A2010A0112，A2010A0112-2，A2010A0112-3（http://www.BioTNT.com/product/product_32252.html）
探针法主要应用于病毒RNA的检测；以及单位点突变（SNP）；多基因的合并检测；举例：
如果某mRNA 有多个亚型，很难找到一段扩增产物都一致的部分来设计引物，用探针法可以通过仅找到同源处设计引物和探针的方式，进行多基因的合并检测；但如果用染料法，可能得到的产物有多个，熔解曲线非单峰，检测的数据就很难看；这种情况，适用探针法；探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况；而染料法则必须分管检测。
探针法可以选用：热启动Taqman-PCR PreMix试剂盒（探针）A2010A0103（http://www.BioTNT.com/product/product_32234.html）；
热启动Taqman-PCR探针法多重荧光Premix A2010A0114（http://www.BioTNT.com/product/product_32240.html）
一步RT-Real time PCR 探针法Premix，A2010A0115s，A2010A0115L(http://www.BioTNT.com/product/product_32242.html)
问题三：Real time PCR 相对定量中标准曲线法和deltadelta CT法的选择；
答：一般选择deltadelta CT法；当扩增效率相差比较大的时候，可以采用标准曲线法进行检测和计算；
问题四：Real time PCR 相对定量中的标准曲线法如何进行：
答：主要是相对定量标准品的制作，一般有三种方法：
1、比较复杂的方法：质粒
采用BioTNT 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.BioTNT.com/product/product_32250.html），对目的基因进行real time PCR实验，得到PCR扩增产物；PCR 扩增产物转入质粒中，得到相对定量的标准品；
2、一般采用的方法1：比较强的CDNA 模板
采用BioTNT 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.BioTNT.com/product/product_32250.html），对目的基因进行real time PCR实验，选择比较强的CDNA 模板，一般CT要在20-25之间，对这个CDNA 进行5倍的梯度稀释，一般稀释四到五个点；对梯度稀释的CDNA 进行real time PCR，以CT值为纵坐标，横坐标为CDNA 模板的相对浓度取对数，绘制标准曲线。
3、一般采用的方法：PCR 扩增产物
如果在方法2中找不到比较强的CDNA 模板，则选用PCR 产物作为相对定量的标准品也是可以的；需要注意的事项是：PCR 产物浓度很高，而real time PCR的产物片段比较短，容易在稀释的过程中造成PCR污染，要注意操作。
一般PCR 产物在稀释一万倍以后，作为模板加入1ul到体系中，这时候的CT在10个循环左右，所以建议对PCR模板一万倍的，做100倍稀释，建立标准曲线；
注：标准曲线一般要跨过您要检测的样本的CT，才能比较精确的进行定量；
标准品尽量分布在您样本CT的附近；所以，标准品的稀释倍数，不一定是要一样的；
问题五：Real time PCR mRNA相对定量中内参的选择；
答：一般选择beta-actin， GAPDH <