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技术宝典— qPCR
qPCR 汇总(2)---------Real time PCR mRNA 定量实验路线选择F&Q

Real time PCR mRNA 定量实验路线选择F&Q

 

 

 

问题一:Real time PCR mRNA的相对定量和绝对定量的选择;

测定mRNA, 一般采用相对定量,因为绝对定量,标准品的制备和定量是有难度的,具体可以参考这篇文献:http://www.BioTNT.com/news/news_105.htm

Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method 
       Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen
       Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and †Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
       Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534

 

问题二:Real time PCR 的染料法和探针法的选择;

答:进行mRNA表达量的测定,采用染料法是比较经济实惠的;染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况;目的基因和内参基因分管检测;

染料法可以选用Real time 染料PCR PreMIXA2010A0112A2010A0112-2A2010A0112-3http://www.BioTNT.com/product/product_32252.html

探针法主要应用于病毒RNA的检测;以及单位点突变(SNP);多基因的合并检测;举例:

如果某mRNA 有多个亚型,很难找到一段扩增产物都一致的部分来设计引物,用探针法可以通过仅找到同源处设计引物和探针的方式,进行多基因的合并检测;但如果用染料法,可能得到的产物有多个,熔解曲线非单峰,检测的数据就很难看;这种情况,适用探针法;探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况;而染料法则必须分管检测。

探针法可以选用:热启动Taqman-PCR PreMix试剂盒(探针)A2010A0103http://www.BioTNT.com/product/product_32234.html);

热启动Taqman-PCR探针法多重荧光Premix  A2010A0114http://www.BioTNT.com/product/product_32240.html

一步RT-Real time PCR 探针法PremixA2010A0115sA2010A0115L(http://www.BioTNT.com/product/product_32242.html)

 

 

问题三:Real time PCR 相对定量中标准曲线法和deltadelta CT法的选择;

答:一般选择deltadelta CT法;当扩增效率相差比较大的时候,可以采用标准曲线法进行检测和计算;

 

问题四:Real time PCR 相对定量中的标准曲线法如何进行:

答:主要是相对定量标准品的制作,一般有三种方法:

1、比较复杂的方法:质粒

采用BioTNT 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物(custom primer pairs  http://www.BioTNT.com/product/product_32250.html),对目的基因进行real time PCR实验,得到PCR扩增产物;PCR 扩增产物转入质粒中,得到相对定量的标准品;

2、一般采用的方法1:比较强的CDNA 模板

采用BioTNT 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物(custom primer pairs  http://www.BioTNT.com/product/product_32250.html),对目的基因进行real time PCR实验,选择比较强的CDNA 模板,一般CT要在20-25之间,对这个CDNA 进行5倍的梯度稀释,一般稀释四到五个点;对梯度稀释的CDNA 进行real time PCR,以CT值为纵坐标,横坐标为CDNA 模板的相对浓度取对数,绘制标准曲线。

3、一般采用的方法:PCR 扩增产物

如果在方法2中找不到比较强的CDNA 模板,则选用PCR 产物作为相对定量的标准品也是可以的;需要注意的事项是:PCR 产物浓度很高,而real time PCR的产物片段比较短,容易在稀释的过程中造成PCR污染,要注意操作。

一般PCR 产物在稀释一万倍以后,作为模板加入1ul到体系中,这时候的CT10个循环左右,所以建议对PCR模板一万倍的,做100倍稀释,建立标准曲线;

注:标准曲线一般要跨过您要检测的样本的CT,才能比较精确的进行定量;

标准品尽量分布在您样本CT的附近;所以,标准品的稀释倍数,不一定是要一样的;

 

问题五:Real time PCR mRNA相对定量中内参的选择;

答:一般选择beta-actin GAPDH <

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