IF 18.505| BioTNT助力生物材料研究：通过生物模拟支架将诱导多能干细胞重编程为类似睫状体上皮细胞的细胞，用于构建睫状小带纤维
2025年3月，复旦大学附属耳鼻喉科医院在国际期刊《Bioactive Materials》上发表的，题为“Reprogramming of iPSCs to NPCEC-like cells by biomimetic scaffolds for zonular fiber reconstruction”的论文。Tianhui Chen,Zhongxing Chen, Juan Du同位第一作者，Jinhai Huang, Chen Xu, Hongmei Zhang, Yongxiang Jiang为通讯作者。
背景：晶状体异位（Ectopia lentis, EL）是一种影响儿童的疾病，估计每10万名儿童中有6.4例，其中45%的病例发生在4至5岁之间，这表明其在儿童期早期发病。作为儿童晶状体手术的第二大原因，EL需要手术干预，因为维持晶状体在正常解剖位置的悬韧带纤维功能失调。FBN1基因（编码弹性纤维蛋白-1）是EL发病机制中常见的突变位点，导致非色素睫状上皮细胞（NPCEC）产生结构失调的FBN1蛋白。这些变化可能导致悬韧带纤维发育不良、减弱或断裂，危及晶状体的定位和机械完整性，可能导致受影响患者失明。EL的手术管理极具挑战性，主要涉及晶状体切除术或囊袋切除术，通常伴随前部玻璃体切除术。然而，这些手术程序由于广泛的组织切除而与术后并发症相关。报告的并发症包括玻璃体出血（1.3%–4.5%）和视网膜脱离（4.1%–17.2%）。术后临床并发症，包括人工晶状体移位和角膜内皮失代偿，也是关注的问题。无论是术后并发症还是未经治疗的EL，通常都会导致严重的视力损害，给受影响的患者、家庭和社会带来沉重负担。为了应对EL治疗的需要，探索微创手术方法，例如通过玻璃体腔注射细胞来修复悬韧带纤维病变，是一个有前景的方向。
研究信息：基于先前研究的见解，我们提出，设计用于模拟晶状体悬韧带微观结构特征的生物模拟电纺支架，可能有效地指导细胞分化并增强悬韧带的修复。本研究首次利用高通量技术分析EL患者的囊膜组织和房水，发现与没有晶状体脱位的个体相比，各种基因的mRNA和蛋白质表达存在显著差异。研究结果表明，EL受影响的眼睛中细胞外基质发生退行性变化，炎症通路显著激活。通过生物模拟策略促进受损眼悬韧带的修复。本研究是首次调查将iPSC种植在模拟晶状体悬韧带的生物模拟径向电纺支架上，并通过专门的培养条件诱导iPSC分化为具有NPCEC表型的NPCEC样细胞。这种方法不仅解决了原代NPCEC有限可用性的挑战，还建立了一种针对终末眼细胞定向分化的靶向方法。在NPCEC样细胞治疗后，我们观察到晶状体悬韧带中细胞外基质蛋白的表达显著增强，其生物力学性能也显著改善。本研究引入了一种干细胞修复策略，对EL的治疗至关重要，代表了这种疾病以及可能其他眼部疾病的革命性新治疗方法。
使用产品：
|
产品货号
|
产品名称
|
产品规格
|
|
A2010A0901
|
|
120Test
|
|
A2010A0901S
|
|
60T
|
2.8. 生物模拟支架上的iPSC诱导
将NPCEC细胞接种到6孔板中培养2天后，收集上清液，并按照1:4的比例与EpiCult™ Plus培养基（STEMCELL，中国）混合，制备诱导培养基。随后，将iPSC细胞按照上述方法接种到支架上，并添加这种诱导培养基进行iPSC培养。为了进行免疫荧光染色，细胞首先用4%的多聚甲醛固定20分钟，然后用0.5%的Triton X-100处理15分钟，接着用5%的牛血清白蛋白（BSA）在PBS中封闭30分钟。之后，细胞在4°C下与兔抗FBN1抗体（1:200，Abcam）或兔抗MFAP2抗体（1:200，Abcam）孵育过夜，随后在室温下与FITC标记的二抗（1:200，Abcam）孵育1小时。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）盐酸盐染色，细胞骨架用罗丹明标记的鬼笔环肽（Abcam，美国）染色，最后通过共聚焦荧光显微镜（Zeiss LSM880，德国）进行观察。对于定量聚合酶链式反应（qPCR），使用了qPCR SYBR Green检测试剂盒（A2010B0B01，BioTNT），并通过ViiA 7实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）检测信号。反应程序为：95°C初始变性，随后进行40个循环，每个循环包括95°C变性15秒和60°C退火30秒。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为参考基因。GAPDH、FBN1和MFAP2的引物购自Invitrogen，具体的引物序列记录在表S1中。
结果：
EL患者的囊膜组织表现为细胞外基质（ECM）失调。(a) EL患者临床样本检测流程的概念图。(b)火山图显示EL患者样本与年龄相关性白内障（ARC）患者样本之间差异基因表达模式。(c)对ARC和EL患者样本之间差异表达基因的聚类分析。(d)基因本体（GO）富集分析结果，显示ARC和EL患者样本之间差异表达基因的富集情况。(e)与ARC和EL患者样本之间差异表达基因相关的KEGG桑基图，显示富集的通路。(f) EL和ARC患者囊膜组织样本中相对基因表达的比较qPCR分析（n = 3）。(g) EL和ARC患者囊膜组织的免疫荧光染色，包括DAPI（蓝色）、细胞骨架（红色）和FBN1（绿色）染色。比例尺为50微米。数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。
生物模拟支架支持iPSC向NPCEC样细胞分化。(a) iPSC细胞接种在径向支架上的示意图。(b)和(c) 在不同支架区域培养的iPSC细胞的扫描电子显微镜（SEM）图像。(d)在不同支架区域培养的iPSC细胞的免疫荧光染色，包括DAPI（蓝色）、细胞骨架（红色）和FBN1/MFAP2（绿色）染色。(e–h)在不同支架区域培养的iPSC细胞的半定量分析（n = 3）和CCK-8实验分析（n = 4）。(i–l)在不同支架结构上进行NPCEC诱导和培养后，FBN1和MFAP2表达的半定量和RT-qPCR分析，n = 3。数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。
结论：本研究利用对晶状体异位（EL）患者晶状体脱位机制的现有认识，开发了一种生物模拟电纺支架，该支架能够重现悬韧带纤维的特性。随后，利用这种支架成功诱导诱导多能干细胞（iPSC）体外分化为能够分泌维持悬韧带纤维完整性的关键细胞外基质（ECM）成分的类似非色素睫状上皮细胞（NPCEC）的细胞。这些NPCEC样细胞随后被用于治疗EL的兔模型，结果显示，这种治疗在注射后一个月内恢复了悬韧带纤维微结构的连续性和方向性。总体而言，这些发现为利用生物模拟策略指导iPSC分化提供了新的机会，同时也为将iPSC应用于治疗复杂眼部疾病提供了新的可能性。