IF 18.9| BioTNT助力生物材料研究:针对创伤后骨关节炎诊断和治疗的MMP13靶向siRNA载药胶束
2024年7月,上海大学医学院在国际期刊《Bioactive Materials》上发表的,题为“MMP13-targeted siRNA-loaded micelles for diagnosis and treatment of posttraumatic osteoarthritis”的论文。Dongyang Zhou,Yan Wei,Shihao Sheng,Miaomiao Wang同位第一作者,Jiacan Su, Yan Wei, Fengjin Zhou, Hao Zhang, Zhongmin Shi为通讯作者。
背景:创伤后骨关节炎(PTOA)主要由机械性关节损伤引起。这种损伤常发生在军人和年轻运动员中,并导致病理进程加速,使得患者比原发性骨关节炎(OA)患者早7-9年需要进行手术干预。尽管PTOA仅占全球OA病例的约12%,但由于影响年轻患者且进展迅速,它造成了更严重的社会经济负担。目前,OA的诊断主要依赖于患者的症状报告和X光成像。X光成像一直被认为是“金标准”,但它无法检测到早期疾病和细微变化。这一局限性导致PTOA通常在中晚期才被诊断出来,而此时的治疗手段仅限于缓解症状,如炎症和疼痛。因此,迫切需要新的策略来早期诊断并及时干预OA。
研究信息:在此,我们构建了一种集成诊断和治疗的胶束,该胶束经过修饰,包含可被MMP13酶切割的、含有花青素5(Cy5)的PEG、黑色猝灭剂3(BHQ3)和cRGD配体,并载有能够沉默MMP13的siRNA(siM13),命名为ERMs@siM13。ERMs@siM13能够在病变软骨组织中被MMP13切割,从而脱落PEG外壳,暴露出cRGD配体。相应地,配体的暴露通过与细胞表面的αvβ3整合素结合,促进了胶束被病变软骨细胞摄取,增加了细胞内siM13的传递,从而按需下调MMP13。同时,Cy5荧光通过与含有BHQ3的胶束分离而恢复,精确地反映了病变软骨的状态。特别是,由ERMs@siM13产生的依赖于MMP13水平的Cy5荧光强度能够反映PTOA的严重程度,使医生能够调整治疗方案。最后,在PTOA小鼠模型中,ERMs@siM13能够诊断早期PTOA,及时进行干预,并通过实时检测MMP13来监测治疗期间骨关节炎(OA)的进展水平。因此,ERMs@siM13是早期PTOA诊疗的一个有吸引力的方法。
使用产品:
产品货号
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产品名称
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产品规格
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cust-siRNA-2
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2 OD HPLC
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cust-siRNA-5
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5 OD HPLC
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2.1. 材料
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)和DSPE-PEG2000-NH?购自上海毕得医药科技有限公司(中国上海)。花青素5(Cy5)-C(PEG2000)-GPLGVRGK-NH?(即EP)和Cy5-C(PEG2000)-GplgvrGK-NH?(即nEP)由安徽国平医药有限公司(中国安徽)合成,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)/质谱(MS)确认其成功合成。多种能够沉默MMP13的siRNA(siM13s)由上海冠泰生物有限公司(中国上海)合成:siRNA-1:5′-GGAGUUAUGAUGAUGUUAATT-3′;siRNA-2:5′-GAGAAACUAUGAUCUUUAATT-3′;siRNA-3:5′-CAAAGUAGAUGCUGUCUAUTT-3′。Lipofectamine 3000和LysoTracker Red购自美国纽约的Invitrogen公司。重组人MMP13前体酶(511-MM-010)购自美国明尼苏达州的R&D Systems公司。DSPE-PEG2000-NHS购自上海芃圣生物有限公司(中国上海)。DSPE-PEG2000-c(RGDfK)(DSPE-PEG-cRGD)购自西安瑞禧生物科技有限公司(中国西安)。BHQ3-NHS购自长沙瀚辰生物科技有限公司(中国长沙)。DOTAP购自上海艾伟拓医药科技有限公司(中国上海)。重水(D?O)购自上海阿达玛斯有限公司(中国上海)。细胞计数试剂盒8(CCK-8)和BeyoClick™ EdU细胞增殖试剂盒(带Alexa Fluor 647)购自上海碧云天生物技术有限公司(中国上海)。香豆素6(C6)和1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳氰基碘化物(DiR)购自上海翌圣生物技术有限公司(中国上海)。透析袋(截留分子量:3500道尔顿)购自美国Viskase公司。小鼠MMP13酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国加利福尼亚州的Biolegend公司。除非另有说明,所有其他试剂均购自上海麦克林试剂有限公司(中国上海)。
结果:
ERMs@siM13在早期创伤后骨关节炎(PTOA)小鼠模型中的作用机制。(A) ERMs@siM13的制备过程示意图及其通过基质金属蛋白酶13(MMP13)介导的激活机制。(B)在早期PTOA关节内注射后,ERMs@siM13可以被病变软骨细胞周围过表达的MMP13激活,从而脱落带有Cy5的PEG保护壳。相应地,cRGD配体暴露出来,促进载有沉默MMP13的siRNA(siM13)的胶束被病变细胞摄取,实现按需下调MMP13,同时恢复Cy5荧光以报告软骨组织的病变状态。
ERMs@siM13的制备与表征。(A)花青素5(Cy5)-C(PEG2000)-GPLGVRGK-NH?(EP)和Cy5-C(PEG2000)-GplgvrGK-NH?(nEP)在与基质金属蛋白酶13(MMP13)孵育前后的高效液相色谱(HPLC)光谱图。(B)代表性流式细胞仪直方图显示病变软骨细胞对带有不同cRGD修饰密度的香豆素6(C6)标记的RMs的摄取情况,以及(C)相应的C6的平均荧光强度(MFI)。(D) 代表性流式细胞仪直方图显示病变软骨细胞对具有不同cRGD:PEG比例的nERMs@C6的内化情况,以及(E)相应的C6 MFI。(F)含有不同摩尔比的BHQ3与Cy5的nERMs的代表性荧光光谱和荧光图像。(G) ERMs@siM13的代表性透射电子显微镜(TEM)图像。标尺:50纳米。(H) ERMs和nERMs在与MMP13孵育前后的代表性荧光光谱和荧光图像。(I)通过琼脂糖凝胶电泳测定由RMs、ERMs和nERMs载有的siM13的血清稳定性。游离siM13作为对照组。“E”代表MMP13。数据以平均值±标准差(SD)表示。*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,以及ns表示使用非参数双尾方差分析在标记组间无显著差异。
ERMs@siM13对病变软骨细胞的诊断和治疗效果。(A) 用指定的配方处理病变软骨细胞,然后与ERMs共孵育2小时以诊断软骨细胞的状态。正常软骨细胞作为对照组。(B) 从(A)图计算得出的Cy5的平均荧光强度(MFI)。(C) 与PBS对照组相比,病变软骨细胞在经过RMs@siM13、nERMs@siM13和ERMs@siM13处理后的Mmp13 mRNA水平。(D) 经过上述处理后,显示MMP13、Col 2和GAPDH蛋白水平的代表性蛋白质免疫印迹图像以及相应的MMP13和Col 2的平均蛋白表达量。(E-F) 对经过上述处理后的病变软骨细胞进行(E)MMP13和(F)Col 2的免疫荧光染色及半定量分析。(G) 通过EdU染色测定上述处理后的病变软骨细胞的增殖实验。计算与PBS对照组相比的EdU+细胞比例。标尺:100微米。数据以平均值±标准差(SD)表示。*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,以及ns表示使用非参数双尾方差分析在标记组间无显著差异。
ERMs@siM13在PTOA小鼠模型中的体内递送和诊断效果。(A) 在关节内注射ERMs@DiR和nERMs@DiR后,PTOA小鼠关节在不同时间点的代表性荧光图像。(B) 对(A)图中的荧光信号进行定量分析。(C) 显示ERMs@C6和nERMs@C6穿透健康和PTOA软骨的代表性共聚焦图像。(D) 从(C)图计算得出的C6的平均荧光强度(MFI)。(E) PTOA小鼠每5天接受一次ERMs@siM13和nERMs@siM13治疗,共9个周期。在预设时间点关节内注射ERMs以监测PTOA的进展。(F) 从(E)图计算得出的Cy5 MFI。(G) 按上述方法处理PTOA小鼠。在预设时间点收集关节并进行MMP13的免疫荧光染色。(H) 从(G)图计算得出的MMP13 MFI。标尺:100微米。数据以平均值±标准差(SD)表示。*P < 0.05,***P < 0.001,以及ns表示使用非参数双尾方差分析在标记组间无显著差异。
ERMs@siM13在创伤后骨关节炎(PTOA)小鼠中的治疗效果。(A) 用指定配方处理后,第4周和第8周关节软骨的代表性苏木精-伊红(H&E)染色图像。(B) 经过4周或8周治疗后关节软骨的代表性番红O-固绿染色图像。(C) 使用Mankin评分评估(B)图中第4周和第8周的骨关节炎(OA)严重程度。(D) 通过微计算机断层扫描(Micro-CT)检查治疗后第8周的骨赘(白色箭头)形成情况。(E) 从(D)图中量化骨赘数量。标尺:200微米。数据以平均值±标准差(SD)表示。*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,以及ns表示使用非参数双尾方差分析在标记组间无显著差异。
免疫组化(IHC)染色评估假手术或创伤后骨关节炎(PTOA)小鼠膝关节在治疗4周和8周后的变化。(A) 经指定配方处理后,小鼠软骨中MMP13的代表性IHC染色图像。假手术组作为正常对照。(B) 从(A)图计算得出的MMP13阳性(MMP13+)区域百分比(%)。(C) 经指定配方处理后,小鼠软骨中II型胶原蛋白(Col 2)的代表性IHC染色图像。(D) 从(C)图计算得出的Col 2阳性(Col 2+)区域百分比(%)。(E) 经指定配方处理后,小鼠软骨中聚集蛋白多糖(aggrecan,ACAN)的代表性IHC染色图像。(F) 从(E)图计算得出的ACAN阳性(ACAN+)区域百分比(%)。标尺:100微米。数据以平均值±标准差(SD)表示。*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,以及ns表示使用非参数双尾方差分析在标记组间无显著差异。
ERMs@siM13的生物安全性评估。(A) 健康小鼠在关节内单剂量注射指定配方后第5天,膝关节滑膜的代表性苏木精-伊红(H&E)染色图像。标尺:100微米。(B) 创伤后骨关节炎(PTOA)小鼠在每5天接受一次指定配方治疗,持续8周后,主要器官的代表性H&E染色图像。标尺:200微米。
结论:
在本研究中,开发了一种集成诊断和治疗功能的胶束ERMs@siM13,通过靶向病变软骨组织中过表达的MMP13来诊断和干预早期创伤后骨关节炎(PTOA)。在缺乏MMP13的正常软骨中,ERMs@siM13保持荧光淬灭状态,从而降低背景噪声,并且由于PEG包合的EPs屏蔽了cRGD配体,避免了非特异性细胞摄取。相比之下,当到达病变软骨细胞时,过表达的MMP13能够脱落PEG外壳,恢复Cy5荧光,用于早期骨关节炎(OA)的诊断,并暴露cRGD配体以增加细胞内化和按需治疗(即MMP13下调)。因此,ERMs@siM13通过恢复软骨基质代谢的平衡,有效地延缓了早期OA的进展。此外,ERMs@siM13能够通过及时响应不同水平的MMP13来实时报告OA进展的程度,这反映了PTOA的严重程度。最后,ERMs@siM13在PTOA小鼠模型中实现了早期PTOA的有效诊断和及时干预,且未引起额外的副作用,这为未来在临床应用中的进一步探索提供了依据。