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技术宝典—磁珠、琼脂糖珠和IP试剂盒
免疫沉淀(IP)系列: 敲黑板 — IP(免疫沉淀)实验抗体如何选?

 

很多生物学实验都需要使用抗体,例如WBIPIF等等,不同的实验对于抗体的选择是有差异的,如果抗体选择不合理,实验的结果将很难达到理想效果。那么IP(免疫沉淀)实验如何选择抗体呢?来了解一下吧

一、在IP实验中,抗体需要通过识别抗原的构象表位并与靶蛋白结合沉淀出来,而只能识别线性表位的抗体则无法做到这一点。所以开始IP实验之前,一定要先确定所选抗体适用于IP实验。

Anti-HA tag Antibody 为例

 

 

另外,一般IPWB在抗体稀释比上有不同,这一点也需要明确。

 

二、尽量选择已发表高分文献中经常引用的品牌以及货号。

一般文献中报道的品牌货号产品已经过验证,再结合文章中的数据,择优选择。

三、所选抗体与结合蛋白Protein A/G的亲和力弱,无法将抗体与目的蛋白复合物沉淀下来。

 

由于不同物种的不同蛋白亚型与结合蛋白的亲和力都不相同,选择相应的结合蛋白才能保证实验顺利。可以根据下表来选择与所用抗体亲和力强的结合蛋白:

 

 

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如果IP所涉及目的蛋白带有相关标签,如Flag tagHA tag等。那么实验中,既可以选择IP级别的抗体并配套相关磁珠(Protein A/G Magnetic beads),也可以直接选用相关标签蛋白抗体磁珠,比如Biolinkedin®Anti-Flag Magnetic beads

 

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如果目前所涉及抗体实在无法满足IP实验需要,我们也可以考虑利用链霉亲和素-生物素系统(Streptavidin-Biotin System),将目的蛋白生物素化标记,并通过   Streptavidin Magnetic beads对目的蛋白进行免疫沉淀。

 

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四、Western Blot 55kD以及25kD出现条带。

多出来的两条,其实是IgG的重链和轻链WB实验上样之前,样品一般要煮沸变性并去除Protein A/G beads,缓冲液中的巯基乙醇会将抗体重链和轻链之间的二硫键破坏,使抗体分子变成55kD的重链分子和25kD的轻链分子。

 

IP实验抗体与后续用于Western Blot实验的抗体来源种属可以选择不同。如果IP抗体是鼠源的,那么后续WB的抗体可以选择兔源的。

 

五、单多克隆抗体的选择。

 

一般单克隆抗体特异性强,背景低,亲和力可能会低一点,检测抗原灵敏度可能也会略低一点;多克隆抗体特异性一般稍弱一些,抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性条带。抗体是多克隆还是单克隆,一般为了特异性结合会选单克隆,但如果蛋白丰富低或其他条件条带很难跑出来,可以买多克隆。

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