一、抗体亲和纯化

纯化抗体的方法多种多样，其选择取决于后续应用、来源种类、免疫球蛋白(Ig)类别和亚类以及起始材料的来源。认识到没有一种单一的方法可以满足所有应用的需求是很重要的，但是本文中详细介绍了适用于大多数IgG纯化的常用方法。为了最大限度地纯化IgG，我们利用高容量IgG结合特异性细菌蛋白固定在固相载体上，如琼脂糖凝胶或琼脂糖磁珠。用于纯化抗体的细菌蛋白，如(1)来自金黄色葡萄球菌的Protein A，(2)来自链球菌的Protein G，(3)来自大胃链球菌的Protein L。每一种蛋白都具有独特的Ig结合特性，如表1所示，可用于从各种基质如血清、培养上清液或腹水中纯化抗体。

表1   protein-A, protein-G, and protein-L的抗体结合特性

多克隆抗体经常作为从免疫动物血液中获得的抗血清提供。原抗血清含有大量干扰免疫测定的外源蛋白，常用Protein A或Protein G来清除大量不需要的血清蛋白。抗血清中还含有大量针对非抗原靶的有害抗体(>95%的总IgG)，而这些非特异性的Ig蛋白并没有被这种纯化方法去除。单克隆抗体通常作为杂交瘤培养上清或接种杂交瘤细胞系后从小鼠腹腔内收集的腹水提供。与多克隆抗血清相似，单克隆抗体可以通过Protein A或Protein G的方法纯化，但与抗血清不同的是，在粗产物中存在的大多数免疫球蛋白都是针对靶抗原的单一类/亚型。Protein L通常可以替代ProteinA或Protein G，我们利用其不能与牛IgG结合的优势，从混入胎牛血清的杂交瘤培养上清中纯化小鼠IgG。表2给出了这三种抗体结合蛋白对不同物种IgG类型的相对结合亲和力。由于Protein A或Protein G都不能结合鸡来源的IgY抗体，所以只能用Protein L纯化鸡来源的IgY抗体。在纯化前，应在适当的缓冲液中稀释粗抗血清和腹水，以调整结合pH值，并尽量减少体积蛋白负载效应，从而阻止所需的抗体与固相载体的结合。

表2   protein-A, protein-G, andprotein-L对不同种属抗体的相对亲和能力

二、“四大名捕”升级“五大名捕”

1. Protein A

从原核金黄色葡萄球菌细胞壁分离的结合受体Protein A(~56kDa)与不同免疫球蛋白同型的Fc区以及人V_H3家族的Fab区具有高度的亲缘关系。进一步研究表明，Protein A仅限于与IgG亚类IgG₁、IgG₂和IgG₄结合，与IgG₃的反应性很低，约占总IgG的8%。天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域，结构示意图如下：

图1   Protein A的结构域示意图

此结构的ProteinA大量结合IgG的同时，其非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够，因此科学家利用基因工程的方法克隆Protein A的基因并进行改造，得到重组型Protein A，其非特异性结合明显降低。重组的Protein A经过改造后有一个C端的半胱氨酸，可以单点偶联到琼脂糖凝胶和琼脂糖磁珠上，降低空间位阻的同时提高IgG的结合能力。一步亲和层析后样品纯度可超过90%。

2. Protein G

Protein G是一种源自链球菌G族的细胞壁蛋白，分子量25kDa，为三型Fc受体。Protein G可与IgG的Fc区域特异性结合，与Protein A相比对IgG具有更好的结合能力，血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。天然的ProteinG还能与大多数物种（包括大鼠和山羊）的免疫球蛋白结合，并能识别大多数类和亚类。虽然Protein G与蛋白白蛋白也有很高的亲和性，这可能会导致污染问题。重组Protein G已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然Protein G和Protein A有更大的优势。

Protein G作为亲和配基被偶联到琼脂糖凝胶或琼脂糖磁珠上，即Protein G琼脂糖凝胶和Protein G琼脂糖磁珠，可以特异性地与样品中的抗体结合，Protein G可以结合所有人和鼠的IgG抗体亚型包括鼠的IgG₁。Protein G也可以与小鼠的IgG_2a和IgG_2b结合，而Protein A不行。

图2   Protein G与Protein A的结合位点差异

3. Protein L

Protein L是从马格努斯消化链球菌分离出来的能和免疫球蛋白特异性结合的蛋白，分子量36kDa，与Protein A和ProteinG结合到抗体的Fc区不同的是，Protein L是通过轻链相互作用结合的抗体。因为重链的任何部分都不会参与结合相互作用，Protein L结合更宽范围的抗体类，包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD，单个轻链（scFv）或者F_ab片段。因此，与Protein A和Protein G相比，Protein L能与更广泛的含有kappa轻链的免疫球蛋白类结合，是亲和层析和抗体固定化的有利工具。

图3   抗体基本结构和Protein A、Protein G、ProteinL结合位点

4. Protein A/G

以基因工程方法重组的Protein A/G包含Protein A的5个免疫球蛋白结合区域和Protein G的2个结合区域，结合能力较单一的Protein A和Protein G有很大提高。更强的Fc段结合能力使之成为免疫球蛋白纯化更受青睐的工具。Protein A/G结合人的所有IgG亚型和IgA、IgE、IgM及少量的IgD。

5. 耐碱Protein A

Protein A来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。耐碱Protein A改造了天然Protein A中的抗体结合域，改造后的配基含有多个与IgG结合的结构域，洗脱条件更为均一和温和，并具有优异的耐碱性能。

考虑到药物GMP生产的无菌、无热源要求，在操作中经常需要使用NaOH清洗，以便去除残留在层析介质上的杂质和热源，因此，优异的耐碱性能对于ProteinA介质也尤其重要。

三、ProteinA、G、L、A/G、耐碱Protein A的应用

3.1 抗体纯化

Protein A、G、L、A/G、耐碱Protein A最经典的应用就是将其偶联在琼脂糖凝胶或琼脂糖磁珠上进行抗体的纯化，如我司BiolinkedinÒ的抗体纯化系列产品（表3）。

表3   BiolinkedinÒ的抗体纯化系列产品

3.2 免疫沉淀or 免疫共沉淀

Protein A、G、L、A/G、耐碱Protein A另外一个重要的应用是免疫（共）沉淀（IP&Co-IP）。免疫沉淀（IP）是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的方法。需要从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋白和其他生物分子时，免疫沉淀是最常用的方法之一。我司BiolinkedinÒ的特色产品就是免疫（共）沉淀系列，如下表4所示。

表4   BiolinkedinÒ的免疫沉淀系列产品

【1】Hnasko, R.M., McGarvey, J.A. (2015). Affinity Purification ofAntibodies. In: Hnasko, R. (eds) ELISA. Methods in Molecular Biology, vol 1318.Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2742-5_3.

【2】Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., Ma, H.,O’Kennedy, R. (2017). Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography.In: Walls, D., Loughran, S. (eds) Protein Chromatography. Methods in MolecularBiology, vol 1485. Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6412-3_15.